曾 穎，余 壘，朱新儒，李 雄，張海德*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 海口 570228）

木瓜蛋白酶廣泛存在于番木瓜（Carica papaya）的根、莖、葉和果實內(nèi)，其在未成熟的果實中含量最豐富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，屬于含巰基（—SH）肽鏈內(nèi)切酶，具有酶活力高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點，因此在食品[1]、醫(yī)藥[2]、飼料[3]、日化[4]、皮革[5]及紡織[6]等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，在食品及飲料工業(yè)上有獨特的廣闊發(fā)展前途[7]。木瓜蛋白酶具有蛋白酶和酯酶的活性，在酸性、中性、堿性環(huán)境下均能分解蛋白質(zhì)，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力。

對于木瓜蛋白酶分離提取的方法，主要有親和層析分離法、超濾膜分離法、沉淀分離法、萃取分離法以及絮凝法等[8]，這些方法分別都存在一些局限性，有些對酶的穩(wěn)定性存在不利的影響[9]。近年來，木瓜蛋白酶的提取分離方法及其應(yīng)用又有了較大的進(jìn)展[10]。例如王麗彬等[11]運用鹽析及柱層析的方法獲得了比活力為1 184 U/mg的木瓜蛋白酶，萬婧等[12]采用有機(jī)溶劑法分離純化木瓜蛋白酶。王田林等[13]優(yōu)化超濾法對木瓜蛋白酶的純化，得到的酶活力為（9.31±0.27）×104U/mg。這些傳統(tǒng)分離方法工藝較為復(fù)雜，而且具有耗費時間及成本、產(chǎn)品酶活力不穩(wěn)定等缺點，很難進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，不能達(dá)到現(xiàn)代工業(yè)的要求。

雙水相萃取技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種極有前途的新型分離技術(shù)，具有條件溫和、操作簡便和分離效率高等特點。與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取相比，雙水相體系能夠為生物活性物質(zhì)提供一種溫和的環(huán)境，而使其不易失活[14]。因此雙水相萃取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的分離和純化，如大多數(shù)酶和蛋白質(zhì)等都能用雙水相體系進(jìn)行分離純化[15]。傳統(tǒng)的雙水相體系主要類型有高聚物/高聚物、高聚物/無機(jī)鹽、親水有機(jī)物/鹽體系，近年來出現(xiàn)了離子液體/鹽雙水相體系[16]。與傳統(tǒng)雙水相比較，溶液酸度范圍較寬、不易乳化、界面更清晰、離子液體經(jīng)簡單處理可重復(fù)再利用[17]。2003年，Gutowski等[18]采用親水性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑鹽酸鹽（[Bmim]Cl）和磷酸鉀（K3PO4）首次形成了離子液體/鹽雙水相體系。離子液體雙水相結(jié)合了離子液體和傳統(tǒng)雙水相的優(yōu)勢，迅速發(fā)展并在分離生物活性物質(zhì)[19-20]方面被廣泛研究。

用雙水相分離純化木瓜蛋白酶已有一些初步的研究，但主要集中在聚乙二醇和鹽組成的雙水相系統(tǒng)上。鹽析法具有應(yīng)用成熟、操作便捷的優(yōu)點。本研究結(jié)合鹽析法和離子液體雙水相萃取技術(shù)對番木瓜中的木瓜蛋白酶進(jìn)行分離純化，旨在從方法上尋求新的突破，為木瓜蛋白酶的純化提供更多技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番木瓜 海南；木瓜蛋白酶（生物純） 生工生物工程（上海）股份有限公司；[C2mim]N(CN)2、[C4mim]N(CN)2、[C6mim]N(CN)2、[C8mim]N(CN)2蘭州雨陸精細(xì)化工有限公司；(NH4)2SO4、NaOH（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用有限責(zé)任公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠；Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；HJ-5型多功能恒溫攪拌器 常州華奧儀器制造有限公司；GL-20G-II離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及木瓜蛋白酶活力測定

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用Bradford法[21]測定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以酪蛋白為底物，測定木瓜蛋白酶活力[22]?？偯富盍Α⒚富盍厥章?、相對酶活力以及純化倍數(shù)的計算見式（1）～（4）：

式中：EA為加入體系的總酶活力/U；SA為酶的比活力/（U/mg）；m為酶的質(zhì)量/mg。AR為酶活力回收率/%；EAT為上相的酶活力/（U/mL）；VT為上相體積/mL。EAsolv為試劑存在時酶活力/（U/mL）；EAwater為空白對照的酶活力/（U/mL）；PF為純化倍數(shù)；SAi為初始酶的比活力/（U/mg）。

1.3.2 鹽析法制取粗木瓜蛋白酶

在未成熟的新鮮木瓜上縱向均勻劃若干個切口，收集果汁，按體積比1∶1加入含0.2 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L NaCl和0.04 mol/L Cys的緩沖液，離心去雜后獲得粗酶液。取一定量的粗酶液，冰水浴中緩緩加入(NH4)2SO4粉末至一定飽和度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）。4℃、10 000×g離心10 min后，取上清液和沉淀測定酶活力和蛋白質(zhì)含量，確定沉淀所用的最佳飽和度。將分級鹽析后的沉淀溶解在緩沖液中，4 ℃透析6 h，全程磁力攪拌，若出現(xiàn)沉淀，則將其低溫離心，取上清液真空冷凍干燥以備進(jìn)一步分析。

1.3.3 相圖的繪制

在295.15 K的條件下采用濁點法制作雙節(jié)線[23]。分別配制60%的[C2mim]N(CN)2、[C4mim]N(CN)2、[C6mim]N(CN)2、[C8mim]N(CN)2離子液體溶液于大試管中，逐滴加入一定濃度的(NH4)2SO4溶液，直到溶液剛好變渾濁，記下消耗的鹽溶液體積。再加入重蒸水使溶液澄清，重復(fù)上述操作到離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%左右停止操作。計算在溶液渾濁時離子液體和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制相圖。

1.3.4 木瓜蛋白酶的雙水相萃取

以相圖為指導(dǎo)，選取適當(dāng)?shù)狞c配制雙水相體系。取真空冷凍干燥的酶作為雙水相萃取的材料，待分相后，讀取上下相體積并分別測定上下相蛋白質(zhì)量濃度?？紤]離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值對分配系數(shù)（K）和萃取率（Y）的影響進(jìn)行單因素試驗，其計算公式見式（5）～（7）：

式中：R為相體積比；VT和VB分別為上、下相體積/mL；cT和cB分別為雙水相體系中上下相的蛋白酶質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值這3 個影響較為顯著的因素，用Design-Expert 8.0.5軟件設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Codes and levels of independent variables used for response surface methodology

1.3.5 木瓜蛋白酶的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

采用電泳儀進(jìn)行不連續(xù)雙垂直板SDS-PAGE。將木瓜蛋白酶與樣品緩沖液（pH 6.8、0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液1.0 mL、甘油2.0 mL、10% SDS 1.0 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%溴酚藍(lán)1 mL、去離子水5 mL）按一定比例混合使蛋白質(zhì)量濃度在10 μg/μL左右，100 ℃水浴3 min，離心，上樣量10 μL，分離膠12.5%，濃縮膠4.5%。開始電壓60 V，進(jìn)入分離膠后100 V，電泳時間2.5～3.5 h?？捡R斯亮藍(lán)R-250染液染色30 min，放入脫色液中搖床脫色，直至膠片背景藍(lán)色變?yōu)橥耆该鳌?/p>

1.4 數(shù)據(jù)處理與圖形繪制

響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.5進(jìn)行分析，P＜0.05，表示具有顯著性差異。圖形采用Origin 9.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 (NH4)2SO4分級沉淀鮮木瓜汁中的蛋白酶結(jié)果

圖1 鹽析后上清液酶活力及蛋白質(zhì)含量變化曲線Fig. 1 Salting-out curve of the crude enzyme

由圖1可知，當(dāng)(NH4)2SO4飽和度為10%時木瓜蛋白酶相對酶活力變化不明顯，但蛋白含量有所下降，說明部分雜蛋白沉淀下來。隨著(NH4)2SO4飽和度的不斷增加，當(dāng)(NH4)2SO4飽和度繼續(xù)增加到40%以上時，上清液中的酶活力已經(jīng)很低，說明大部分木瓜蛋白酶從可溶性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌恋砦龀觥?NH4)2SO4飽和度到50%時，還有一些雜蛋白也隨之析出。綜合以上情況，采取兩級鹽析分離木瓜蛋白酶，分別選取飽和度為20%和45%

的(NH4)2SO4為其分級沉淀的一級和二級飽和度。先在粗酶液中緩緩加入(NH4)2SO4粉末至終飽和度為20%，離心棄沉淀。再繼續(xù)加(NH4)2SO4粉末至終飽和度為45%，離心收集沉淀。

2.2 離子液體雙水相相圖分析

圖2 295.15 K時[Cnmim]N(CN)2 (n= 2,4,6,8)-(NH4)2SO4雙水相體系相圖Fig. 2 Phase diagram of [Cnmim]N(CN)2 (n=2,4,6,8)-(NH4)2SO4 systems at 295.15 K

在溫度為295.15 K條件下測定[Cnmim]N(CN)2-(NH4)2SO4體系（n=2、4、6、8）的雙節(jié)線，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，離子液體與鹽的成相能力強(qiáng)弱為[C8mim]N(CN)2＞[C6mim]N(CN)2＞[C4mim]N(CN)2＞[C2mim]N(CN)2，離子液體陽離子側(cè)鏈烷基越長，則離子液體疏水性越強(qiáng)，更容易形成雙水相[24]。

為獲得成相劑對成相的影響規(guī)律，并用Merchuk[25]方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，見公式（8）：

式中：wIL、ws分別表示離子液體和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；a、b、c為方程參數(shù)。

由表2可以看出雙節(jié)線數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)效果非常好。

表2 295.15 K時[Cnmim]N(CN)2-(NH4)2SO4雙節(jié)線關(guān)聯(lián)結(jié)果Table 2 Bimodal correlation of [Cnmim]N(CN)2-(NH4)2SO4 system at 295.15 K

2.3 離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶

由圖1可知，在(NH4)2SO4溶液中，木瓜蛋白酶活力與木瓜蛋白酶含量具有較好的相關(guān)性。在一定濃度成相劑組成的離子液體雙水相系統(tǒng)中，木瓜蛋白酶活力與木瓜蛋白酶含量也具有正相關(guān)性。王偉濤等[26]的實驗表明咪唑類離子液體在35%以下沒有明顯的抑制作用。蔡濤等[27]的實驗中咪唑類離子液體木瓜蛋白酶活力具有促進(jìn)作用，在50%以內(nèi)的離子液體可保持酶的相對活力在90%以上。所以為簡化試驗數(shù)據(jù)的測定，采用酶在咪唑類離子液體雙水相中的分配系數(shù)和萃取率作為試驗的響應(yīng)值。

2.3.1 離子液體的選擇

以相圖為指導(dǎo)，用4 種離子液體配制相同質(zhì)量組成的雙水相，加入等量適量的酶液，木瓜蛋白酶的分配系數(shù)（K）以及萃取率的結(jié)果如圖3所示。烷基側(cè)鏈的增長有利于酶從下相轉(zhuǎn)移到上相，但是側(cè)鏈過長疏水性增加反而導(dǎo)致萃取率下降[28]，[C4mim]N(CN)2的萃取率最高，因此選取[C4mim]N(CN)2進(jìn)行單因素試驗優(yōu)化雙水相萃取條件。

圖3 離子液體烷基側(cè)鏈變化對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig. 3 Effect of alkyl chain length of ionic liquid on the partition behavior

2.3.2 離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

保持鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%不變，改變雙水相中離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由圖4可知，離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于30%時，隨著用量的增加，K值和萃取率逐漸增大，大于30%時，離子液體濃度過高，體積排阻效應(yīng)增大導(dǎo)致木瓜蛋白酶在兩相之間的傳遞和在上相中的擴(kuò)散阻力大大增加，不利于蛋白質(zhì)進(jìn)入離子液體相，萃取率明顯降低[29]。因此，選取離子液體[C4mim]N(CN)2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%。

圖4 [C4mim]N(CN)2質(zhì)量分?jǐn)?shù)對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig. 4 Effect of [C4mim]N(CN)2 concentration on the partition behavior

2.3.3 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

固定[C4mim]N(CN)2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，加入等量適量的酶液，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對木瓜蛋白酶的分配行為影響見圖5。由于鹽析作用，鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加會提高萃取率[30]。當(dāng)鹽濃度過大時會使兩相中的分子間相互作用力都變得很大，導(dǎo)致酶集中在兩相之間，萃取率大大下降。所以最適鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%。

圖5 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig. 5 Effects of (NH4)2SO4 concentration on the partition behavior

2.3.4 pH值的影響

圖6 pH值對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig. 6 Effect of pH on the partition behavior

本實驗中所考察的pH值對體系的影響范圍為5.0～11.0，蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)受pH值和等電點的影響，木瓜蛋白酶的等電點是8.78，在等電點及附近，離子液體與蛋白質(zhì)之間主要靠氫鍵作用。從圖6可知，當(dāng)溶液pH值在一定范圍內(nèi)小于等電點時，更多蛋白質(zhì)容易被萃取到離子液體相，這可能是因為此時帶電的蛋白質(zhì)與離子液體的陰陽離子發(fā)生了靜電作用[31]。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理及單因素試驗結(jié)果，選取[C4mim]N(CN)2質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值這3個影響較為顯著的因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗設(shè)計。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of RSM

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the established regression model and significance test

利用Design-Expert 8.0.5軟件對表3試驗結(jié)果進(jìn)行二次多項回歸擬合，得到響應(yīng)值得回歸方程：Y=89.4－0.375A+1.5B+1.125C－1.5AB+0.75AC－9.075A2－1.825B2－3.075C2。各項回歸系數(shù)及其顯著性檢驗結(jié)果見表4。回歸方程中各個變量對響應(yīng)值影響的顯著性由F值檢驗，P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高?；貧w模型P值為0.009 8，說明模型極顯著，A2影響極顯著，說明對萃取率影響較大。

各因素的交互影響見圖7，說明了3 個交互項對響應(yīng)值影響并不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R2值為0.896 8，說明響應(yīng)值的變化有89.68%來源于所選變量。因此，回歸方程可以比較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以用來確定最佳提取條件[32]。通過Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出[C4mim]N(CN)2-(NH4)2SO4系統(tǒng)萃取木瓜蛋白酶的最佳條件為[C4mim]N(CN)2質(zhì)量分?jǐn)?shù)29.76%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.08%、pH 8.18，在此條件下通過回歸方程計算得出萃取率為89.83%。按照優(yōu)化條件進(jìn)行平行驗證實驗，得萃取率平均值為89.01%，與預(yù)測值89.83%比較可知，響應(yīng)面分析所得的模型是可靠的。

圖7 各因素兩兩交互作用影響萃取率的響應(yīng)面圖Fig. 7 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on extraction efficiency

2.5 木瓜蛋白酶純化結(jié)果

2.5.1 純化過程各步驟酶活力分析

分別測定木瓜蛋白酶在本實驗各純化步驟后的比活力，結(jié)果如表5所示。木瓜乳汁經(jīng)離心和冷凍干燥制得的粗酶比活力為110 U/mg，再經(jīng)過鹽析得到的木瓜蛋白酶比活力為348 U/mg。再利用響應(yīng)面試驗分析所得的最優(yōu)離子液體雙水相對酶進(jìn)行純化，得到了比活力為1 056 U/mg的木瓜蛋白酶。從木瓜乳汁中提取的粗酶，經(jīng)過鹽析純化后，純化倍數(shù)為3.16，再經(jīng)過離子液體雙水相萃取后，純化倍數(shù)達(dá)到9.6 倍。在離子液體雙水相純化過程中，在優(yōu)化條件下，酶活力回收率可達(dá)86.72%。

表5 木瓜蛋白酶在純化過程中的酶活力比較Table 5 Summary of purification steps of papain

2.5.2 SDS-PAGE分析

經(jīng)過鹽析以及在最佳雙水相條件下提取的木瓜蛋白酶，通過SDS-PAGE分析，取得了較好的分離效果。從圖8可以看出，購買的木瓜蛋白酶純度較高（條帶1），符合木瓜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量（23 kDa）木瓜乳汁經(jīng)離心冷凍干燥后所得樣品中（條帶2），木瓜蛋白酶的純度比較小，而且還含有許多小分子雜質(zhì)；鹽析過后雜質(zhì)相對減少，木瓜蛋白酶含量增大；再經(jīng)雙水相萃取后，木瓜蛋白酶純化效果較好。

圖8 木瓜蛋白酶的SDS-PAGE圖Fig. 8 SDS-PAGE Electrophoretograms of crude and purified papain

3 結(jié) 論

本研究先用不同飽和度的(NH4)2SO4對木瓜蛋白酶的粗酶液進(jìn)行鹽析，然后再通過離子液體雙水相對木瓜蛋白酶進(jìn)一步分離純化。木瓜乳汁經(jīng)離心和冷凍干燥制得的粗酶比活力為110 U/mg，再經(jīng)過鹽析得到的木瓜蛋白酶比活力為348 U/mg，最后通過離子液體雙水相對酶進(jìn)行純化，得到比活力為1 056 U/mg的木瓜蛋白酶。實驗結(jié)果表明，對木瓜蛋白酶進(jìn)行鹽析的最佳條件是用飽和度為20%和45%的(NH4)2SO4進(jìn)行兩級鹽析，再利用響應(yīng)面試驗得出雙水相萃取的最優(yōu)條件為[C4mim]N(CN)2質(zhì)量分?jǐn)?shù)29.76%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.08%、pH 8.18，在此最優(yōu)條件下，木瓜蛋白酶的純化倍數(shù)達(dá)到9.6 倍，萃取率為89.01%，酶活力回收率為86.72%。相較于傳統(tǒng)的親和層析、沉淀和超濾等方法，本實驗所采取的純化方法大大縮短了時間成本，在提高萃取效率的同時降低了酶活力的損耗。最后通過SDS-PAGE對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，證明了鹽析法聯(lián)合離子液體雙水相純化木瓜蛋白酶的效果非常好，為進(jìn)一步的深入研究提供了參考和研究方向。