楊希娟，黨 斌，樊明濤*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.青海大學(xué) 青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

臨床試驗(yàn)和流行病學(xué)研究表明日常膳食中攝入一定量全谷物可有效預(yù)防多種慢性疾病，如心血管疾病和癌癥等。研究認(rèn)為全谷物與氧化應(yīng)激相關(guān)的慢性病有密切關(guān)系，在一定程度上有助于緩和慢性病的發(fā)展[1-3]。而全谷物中的酚類物質(zhì)作為重要的膳食抗氧化組分，具有預(yù)防機(jī)體氧化應(yīng)激的功效，對(duì)人類的心血管疾病、糖尿病、肥胖和腫瘤等具有突出的防護(hù)作用[4-6]。青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.）是大麥的一種，因其籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，故稱裸大麥[7]。生長(zhǎng)在海拔約1 400～4 700 m的青藏高原，是青藏高原區(qū)域第一大作物和藏區(qū)農(nóng)牧民賴以生存的主要口糧[8-9]。多酚是大麥中一類豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，現(xiàn)有研究指出大麥中的酚類物質(zhì)含量（0.2%～0.4%）遠(yuǎn)高于其他谷物[10]，并研究報(bào)道了不同種類、不同顏色大麥中多酚的組成、含量及抗氧化活性[11]。但是已有報(bào)道多關(guān)注的是皮大麥，而關(guān)于青藏高原區(qū)域生長(zhǎng)的青稞中多酚的含量及其活性研究較少。

可食植物中天然存在的大部分多酚都是以游離或結(jié)合的形式存在，且不同植物的化學(xué)組成差異導(dǎo)致不同植物中多酚的最適提取溶劑不同[12-13]?，F(xiàn)已有研究證明提取溶劑及方法對(duì)大麥[14]、荔枝果肉[15]、紅薯葉[16]、石榴果肉[17]等不同植物資源中多酚含量及抗氧化活性有顯著影響，但是關(guān)于提取溶劑對(duì)青稞中多酚含量及抗氧化活性影響的報(bào)道較少。申迎賓等[4]研究提取溶劑對(duì)青稞提取物總酚、黃酮含量及其抗氧化活性的影響，忽略了提取溶劑對(duì)結(jié)合酚的影響；徐菲等[18]研究青稞結(jié)合酚的提取優(yōu)化工藝，但其以青稞麩皮為原料，未考慮溶劑對(duì)青稞全谷物中結(jié)合酚的影響，且鮮見(jiàn)不同溶劑提取對(duì)青稞不同形態(tài)多酚組成影響的深入報(bào)道。因此，本研究以4 個(gè)不同品種青稞為原料，系統(tǒng)研究不同提取溶劑對(duì)青稞游離酚及結(jié)合酚組成與抗氧化活性的影響。旨在建立適于青稞全谷物游離酚和結(jié)合酚提取的方法，為青稞中多酚類物質(zhì)及功能性全谷物食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞品種：13YN-5、946、瓦藍(lán)、昆侖15號(hào)，均由青海省農(nóng)林科學(xué)院作物育種栽培研究所青稞研究室提供。樣品收獲后脫粒，室溫晾干，去除顆粒石子。用萬(wàn)能粉碎機(jī)將青稞種子粉碎，過(guò)60 目篩得青稞全谷物粉。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三吡啶三吖嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、水溶性VE（Trolox）、2,2’-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS） 美國(guó)Sigma公司；沒(méi)食子酸、根皮酚、原兒茶酸、綠原酸、表兒茶素、2,4-二羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、水楊酸、苯甲酸、藜蘆酸、鄰香豆酸、蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、楊梅素、槲皮素、柚皮素、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%） 上海源葉生物科技有限公司；福林-酚試劑（優(yōu)級(jí)純） 北京索萊寶科技有限公司；丙酮、正己烷、甲醇、氫氧化鈉、硫酸、乙酸乙酯、碳酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5430R離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司；Retavapor R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi有限公司；N4S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；雷磁PHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲波儀器有限公司；600E-2487高效液相色譜儀 美國(guó)沃特世科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞游離酚的提取

稱取不同品種的青稞全粉1 g，分別加入25 mL 80%甲醇溶液、80%乙醇溶液、80%丙酮溶液及純水，室溫條件下500 W超聲波處理30 min，離心（4 000 r/min，20 min），收集上清液，殘?jiān)猛瑯臃椒ㄌ崛? 次，合并3 次上清液，45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，沉淀物用甲醇定容至10 mL，0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，得青稞游離酚類物質(zhì)提取液，－20 ℃避光保存[19]。

1.3.2 青稞結(jié)合酚的提取

1.3.2.1 堿法

向提取過(guò)游離酚的殘?jiān)? g）中加入20 mL正己烷，2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，向沉淀物中加入20 mL 2 mol/L NaOH溶液，充入氮?dú)饷芊夂笤谑覝貤l件下振蕩1 h。所得水解液用濃HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至1，再用20 mL乙酸乙酯萃取5 次，離心（3 000 r/min，5 min），合并乙酸乙酯萃取相，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘余物用甲醇定容至10 mL，0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，得青稞結(jié)合酚類物質(zhì)提取液，－20 ℃避光保存[20]。

1.3.2.2 酸法

向提取過(guò)游離酚的殘?jiān)? g）中加入20 mL正己烷，振蕩后離心（2 000 r/min，5 min）棄去上清液，向沉淀物中加入15 mL 10%甲醇-硫酸溶液，70 ℃水浴1 h。用20 mL乙酸乙酯萃取5 次，離心（2 000 r/min，5 min），合并乙酸乙酯萃取相，45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘余物用甲醇定容至10 mL，0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾，得青稞結(jié)合酚類物質(zhì)提取液，－20 ℃避光保存[19-21]。

1.3.3 青稞酚類物質(zhì)含量測(cè)定

1.3.3.1 青稞提取物中酚含量的測(cè)定

采用福林-酚測(cè)定法[18,21]。吸取樣品提取液125 μL于試管中，再加入500 μL蒸餾水和125 μL福林-酚試劑，搖勻，反應(yīng)6 min后加入1.25 mL 7% Na2CO3溶液，再加入1 mL蒸餾水，室溫條件下避光放置1.5 h后，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)3 次。配制不同濃度梯度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。總酚含量以每100 g提取物（干基）中沒(méi)食子酸當(dāng)量計(jì)（mg/100 g）。

1.3.3.2 青稞提取物中黃酮含量的測(cè)定

吸取100 μL樣品提取液于試管中，加入5% NaNO2溶液200 μL，搖勻，6 min后加入10% Al(NO3)3溶液200 μL，搖勻，6 min后再加入4% NaOH溶液2 mL，室溫避光放置15 min后，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)3 次。配制不同溶度梯度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傸S酮含量以每100 g提取物（干基）中兒茶素當(dāng)量計(jì)（mg/100 g）[18,21]。

1.3.4 高效液相色譜定量分析方法

采用高效液相色譜法對(duì)不同方法提取的青稞游離酚與結(jié)合酚提取液進(jìn)行分析[11]。色譜條件：C18制備色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1%冰醋酸，流動(dòng)相B為含0.1%冰醋酸的乙腈溶劑；梯度洗脫：0 min，8% B，92% A；2 min，10% B，90% A；27 min，30% B，70% A；50 min，90% B，10% A；52～56 min，100% B；56～60 min，8% B，92% A。流速0.8 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量20 μL；運(yùn)行時(shí)間60 min。

通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比較，確定色譜峰所屬化合物種類，通過(guò)峰面積計(jì)算化合物含量，結(jié)果以干基表示（μg/g）。

1.3.5 青稞酚類物質(zhì)抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定

吸取樣品提取液1 mL于試管中，再加入4.5 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，充分搖勻后避光反應(yīng)30 min，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)3 次。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=－0.004 2X+0.916 3（0～140 μmol/L，R2=0.992 8）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DPPH自由基清除能力，以每100 g提取物（干基）中Trolox當(dāng)量計(jì)（μmol/100 g）[20-21]。

這給我父親長(zhǎng)了臉，歪嘴的次數(shù)一多，人居然可以坐起來(lái)，雖口齒不清，也能表達(dá)出個(gè)大概。春節(jié)祭祖，族親婚娶，他硬要去呢。用輪椅推到祠堂，我站前排、坐上席，他擠在人堆里。我心里蠻別扭，他倒是開(kāi)心得很。我當(dāng)校長(zhǎng)那年，幾次喝喜酒，都被請(qǐng)入上席首座，真是受寵若驚呀，面對(duì)族長(zhǎng)和那些老成，忐忑不安，一餐飯要掉好幾次筷子，李打油干脆抓一把筷子放在我背后的供案上。我父親每每看到這個(gè)細(xì)節(jié)，嘴就跑到耳朵家去了。

1.3.5.2 鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定

FRAP工作液的配制：300 mmol/L pH 3.6的醋酸鈉緩沖液（3.076 2 g C2H3NaO2加20 mL C2H4O2，用蒸餾水定容至250 mL）、10 mmol/L TPTZ溶液（0.156 2 g TPTZ用40 mmol/L鹽酸溶液定容至100 mL）和20 mmol/L FeCl3溶液，按照體積比10∶1∶1的比例混合，于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱備用。

測(cè)定方法：吸取樣品提取液50 μL于試管中，再加入4.5 mL FRAP工作液，充分搖勻后避光反應(yīng)30 min，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長(zhǎng)593 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)3 次。以Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.007 2X－0.001 2（0～300 μmol/L，R2=0.999 2），其中，Y為吸光度，X為Trolox濃度（μmol/L）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品提取液的FRAP，以每100 g提取物（干基）中Trolox當(dāng)量計(jì)（μmol/100 g）[21]。

1.3.5.3 ABTS+·清除能力測(cè)定

ABTS工作液的配制：將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液混合，室溫避光條件下靜置12～16 h，得ABTS儲(chǔ)備液。將此儲(chǔ)備液按適當(dāng)比例（1∶100，V/V）與無(wú)水甲醇混合，要求其在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度達(dá)到0.7±0.02，得到ABTS工作液，備用。

測(cè)定方法：吸取樣品提取液200 μL于試管中，再加入4 mL ABTS工作液，充分搖勻后避光反應(yīng)30 min，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)3 次。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=－0.001X+0.624 2（0～300 μmol/L，R2=0.990 7）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品提取液清除ABTS+·能力，以每100 g提取物（干基）中Trolox當(dāng)量計(jì)（μmol/100 g）[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3 次，所有結(jié)果以 ±s表示。不同溶劑提取青稞游離酚與結(jié)合酚結(jié)果比較用單因素方差分析，SPSS 21.0軟件進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)?？寡趸芰Ρ容^采用單因素方差分析，DPS 7.05軟件進(jìn)行最小顯著差異法檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑對(duì)青稞中不同形態(tài)多酚含量的影響

2.1.1 提取溶劑對(duì)青稞中游離態(tài)多酚含量的影響

表1 提取溶劑對(duì)青稞提取物游離酚、黃酮含量的影響Table 1 Contents of free phenolics and flavonoids in different solvent extracts from hulless barley mg/100 g

2.1.2 溶劑提取對(duì)青稞中結(jié)合態(tài)多酚含量的影響

表2 水解方法對(duì)青稞提取物結(jié)合酚、黃酮含量的影響Table 2 Effect of hydrolysis methods on contents of bound phenolics and flavonoids in hulless barley extract mg/100 g

如表2所示，酸法提取青稞中結(jié)合酚（172.97～219.26 mg/100 g）、結(jié)合黃酮含量（10.73～23.27 mg/100 g）均顯著（P＜0.05）高于堿法提取液，分別是堿法提取液中含量的1.9～3.1 倍和1.3～2.9 倍。

當(dāng)前，堿水解法被廣泛應(yīng)用于水解植物材料中的結(jié)合酚[20,22-25]，然而本研究發(fā)現(xiàn)酸法水解青稞中的結(jié)合酚，其總酚、總黃酮含量均顯著高于堿法（P＜0.05）。有研究報(bào)道表明，酸法水解的蘋果[26]、桃子[26]、荔枝果肉[15]的結(jié)合酚含量較堿法高。因?yàn)樗岱ㄋ膺^(guò)程采用的高溫更有利于釋放出被包埋在核內(nèi)或偶聯(lián)至細(xì)胞壁膳食纖維或蛋白質(zhì)上的結(jié)合酚類化合物[26-27]。因此，酸水解法較堿水解法更適于提取青稞籽粒中的結(jié)合酚和結(jié)合黃酮化合物。

2.2 提取溶劑對(duì)青稞中不同形態(tài)多酚組成及含量的影響

2.2.1 提取溶劑對(duì)青稞中游離酚類化合物組成及含量的影響

不同溶劑提取的不同品種青稞中游離酚、黃酮的組成及含量如圖1、表3所示。由表3可知，參試青稞的80%丙酮溶液提取物中檢測(cè)到酚類物質(zhì)的組成種類最多為8～18 種，其次為80%甲醇溶液提取物（8～15 種）、80%乙醇溶液提取物（7～13 種），最后為純水提取物（4～13 種），說(shuō)明有色青稞具有更為豐富的酚類化合物組成，與前人報(bào)道[28-29]一致。且參試青稞的80%丙酮溶液提取物中總酚類化合物含量最高，顯著高于（P＜0.05）其他提取溶劑提取液，分別是80%甲醇溶液、80%乙醇溶液與純水提取物的1.08～2.55、1.28～2.60 倍和2.16～4.52 倍。

利用高效液相色譜檢測(cè)到4 種溶劑提取的參試青稞13 種酚酸和8 種黃酮。由表4可知，根皮酚、2,4-二羥基苯甲酸僅在80%丙酮溶液提取物及80%甲醇溶液提取物中檢出，沒(méi)食子酸僅在80%丙酮溶液提取物中檢出，楊梅素在80%丙酮溶液提取物中未檢出，丁香酸和槲皮素在純水提取物中未檢出。兒茶素在80%丙酮溶液、80%甲醇溶液及80%乙醇溶液中平均含量分別為37.39、38.51、30.24 μg/g，提示這3 種溶劑體系對(duì)兒茶素的提取能力相當(dāng)，分別為水提物的3.9、4.0、3.2 倍；綠原酸在80%丙酮溶液及80%乙醇溶液提取物中含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），揭示這2 種溶劑體系對(duì)綠原酸的提取能力相當(dāng)。苯甲酸、藜蘆酸、柚皮素、橙皮苷、槲皮素、蘆丁在80%丙酮溶液提取物中含量顯著高于其他溶劑（P＜0.05），說(shuō)明80%丙酮溶液更容易富集青稞中黃烷酮、黃烷醇類物質(zhì)；2,4-二羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸與山柰酚含量在80%甲醇溶液提取物中顯著高于其他溶劑（P＜0.05），說(shuō)明80%甲醇溶液提取更容易富集羥基苯甲酸類、羥基肉桂酸類及黃酮醇類物質(zhì)；楊梅素在80%乙醇溶液提取物顯著高于其他溶劑（P＜0.05），而純水中的水楊酸平均含量（11.07 μg/g）顯著高于其他溶劑（P＜0.05）。不同提取溶劑對(duì)不同種類單體酚的富集及提取效率不同，80%丙酮溶液能更多地提取出不同品種青稞中的游離酚類化合物，是一種高效提取青稞中游離酚類化合物的溶劑。該結(jié)果與前人報(bào)道[19-20]的丙酮溶液提取植物中游離態(tài)多酚的能力強(qiáng)于甲醇溶液與乙醇溶液相一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)與其他酚類化合物相比，阿魏酸、鄰香豆酸、香草酸、丁香酸、水楊酸、柚皮苷、橙皮苷、楊梅素在參試青稞游離態(tài)提取物中具有較低的含量。

圖1 青稞高效液相色譜圖Fig. 1 Chromatograms of phenolic compounds in different varieties of hulless barley

表4 溶劑提取4 種青稞游離酚的平均含量Table 4 Average contents of free phenolics extracted from 4 varieties of hulless barley with different solvents μg/g

苯甲酸 33.43±61.00a 20.24±36.44b 18.05±30.65c 11.90±14.34d鄰香豆酸 2.56±5.11c 8.60±6.83a 7.20±4.88b 8.56±1.07a藜蘆酸 15.28±6.55a 9.95±0.82b 8.84±2.35c 4.96±5.73d兒茶素 37.39±25.57a 38.51±21.80a 30.24±12.59b 9.60±11.88c柚皮苷 4.20±3.09a 2.82±1.98c 3.82±2.69b 1.06±2.12d橙皮苷 7.03±8.03a 0.97±1.94c 1.26±1.46b 1.37±1.62b楊梅素 ND 1.14±2.28b 3.16±6.32a 0.82±1.65c槲皮素 20.63±33.46a 3.00±6.00b 2.45±4.89b ND柚皮素 10.00±5.33a 5.64±4.84c 6.53±4.44b 3.47±2.94d山柰酚 5.31±6.75b 8.61±3.01a 5.39±3.59b 1.77±3.53c蘆丁 11.41±4.71a 5.24±6.43c 8.82±0.96b 0.98±1.95d

2.2.2 提取方法對(duì)青稞結(jié)合酚類化合物組成及含量的影響

表5 青稞結(jié)合酚的組成及含量Table 5 Bound phenolic composition and content of hulless barleyμg/g

由表5可知，參試青稞的酸法水解物中結(jié)合總酚化合物含量為2 302.32～3 443.19 μg/g，是堿法的2.23～3.11 倍。根皮酚、沒(méi)食子酸、原兒茶酸、綠原酸在參試青稞的堿法提取物中均未檢出，綠原酸在所有參試青稞的酸法提取物中也未檢出。參試4 種青稞中水楊酸在堿法提取物中的含量為422.38～703.91 μg/g，是酸法提取物的25.77～60.44 倍。13YN-5和瓦藍(lán)青稞中的阿魏酸，946、昆侖15號(hào)青稞中的蘆丁，946中的柚皮苷在堿法中顯著高于酸法（P＜0.05），其余大部分結(jié)合態(tài)單體酚在酸法水解物中的含量均顯著高于堿法（P＜0.05）。由此可見(jiàn)酸法更有利于釋放出更多酚類物質(zhì)，是水解青稞結(jié)合酚的有效方法。單體酚含量分析發(fā)現(xiàn)，水楊酸是堿法水解參試青稞的主要結(jié)合酚種類，沒(méi)食子酸、p-香豆酸、丁香酸、苯甲酸、藜蘆酸、橙皮苷是酸法水解青稞的主要結(jié)合酚種類。所有酚類化合物中，根皮酚、2,4-二羥基苯甲酸、原兒茶素、鄰香豆酸、阿魏酸、楊梅素、柚皮素、山柰酚在參試青稞的堿法及酸法提取物中均具有相對(duì)較少的含量。

2.3 青稞不同形態(tài)多酚抗氧化活性比較

2.3.1 提取溶劑對(duì)青稞游離酚抗氧化活性的影響

圖2 提取方法對(duì)不同品種青稞游離酚提取物的抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activity of free phenolic compounds extracted from different varieties of hulless barley with different solvents

如圖2所示，4 個(gè)青稞的80%丙酮溶液提取物DPPH自由基清除能力為852.56～1 484.18 μmol/100 g，其次為80%乙醇溶液提取物（266.15～603.19 μmol/100 g），80%甲醇溶液提取物（407.09～550.91 μmol/100 g），純水提取物清除DPPH自由基的能力最弱（56.60～216.24 μmol/100 g）；不同溶劑提取物的FRAP與清除DPPH自由基的規(guī)律一致，均為80%丙酮溶液提取物的抗氧化能力最強(qiáng)，顯著高于其他溶劑（P＜0.05），其次為80%乙醇溶液提取物，80%甲醇溶液提取物和純水提取物。其中80%丙酮溶液提取物FRAP為1 250.55～2 041.16 μmol/100 g，清除ABTS+?能力為358.93～518.09 μmol/100 g。此結(jié)果與部分學(xué)者研究報(bào)道[19]的結(jié)果一致。

此外，同一溶劑提?。ǔ嵬猓┑牟煌贩N青稞清除DPPH自由基能力均表現(xiàn)出青稞946為最高，瓦藍(lán)、昆侖15號(hào)次之，13YN-5最低；80%丙酮溶液和純水提取4 個(gè)不同品種青稞游離酚的FRAP表現(xiàn)為13YN-5最高，瓦藍(lán)青稞最低，80%甲醇溶液和80%乙醇溶液提取物的FRAP表現(xiàn)為昆侖15號(hào)最高，13YN-5最低。不同品種青稞的抗氧化活性在不同溶劑提取中的差異，一定程度上是不同品種青稞中酚類物質(zhì)組成及含量差異所致。其中青稞946、瓦藍(lán)、昆侖15號(hào)的80%丙酮溶液、80%甲醇溶液、80%乙醇溶液提取物清除ABTS+·能力溶劑間差異不顯著（P＞0.05），究其原因與3 種青稞在不同溶劑中的多酚組成及含量有關(guān)，青稞946的80%丙酮溶液、80%甲醇溶液和80%乙醇溶液中均檢測(cè)到含量相當(dāng)?shù)拈纹に嘏c柚皮苷，瓦藍(lán)青稞在3 種溶劑中均檢測(cè)到含量相當(dāng)?shù)木G原酸、藜蘆酸和柚皮苷，昆侖15號(hào)中均檢測(cè)到相當(dāng)含量的綠原酸，因此可以初步推斷綠原酸、槲皮素、藜蘆酸、柚皮苷是不同溶劑提取物中清除ABTS+·能力的主要貢獻(xiàn)者。以清除DPPH自由基、FRAP、清除ABTS+·能力為衡量指標(biāo)，80%丙酮溶液更適合作為不同品種青稞中游離酚的提取溶劑，此結(jié)果與提取溶劑對(duì)青稞游離酚含量的影響結(jié)果相一致，說(shuō)明多酚類化合物含量與天然植物提取物抗氧化活性有一定的相關(guān)性[30]。

2.3.2 堿法及酸法水解對(duì)青稞結(jié)合酚抗氧化活性的影響

圖3 不同方法提取不同品種青稞結(jié)合酚的抗氧化活性Fig. 3 Antioxidant activity of bound phenolics extracted from differentvarieties of hulless barley with different solvents

如圖3所示，酸法水解物抗氧化活性顯著高于堿法（P＜0.05）。酸法水解不同品種青稞13YN-5、946、瓦藍(lán)、昆侖15號(hào)結(jié)合酚DPPH自由基清除能力、FRAP、ABTS+·清除能力分別為3 142.77～3 505.11、1 266.52～2 021.45、1 401.13～1 850.43 μmol/100 g，是堿法水解的7.6～10.3、1.2～1.8 倍和1.1～1.3 倍。這與酸法水解物含有豐富的酚類化合物有關(guān)。因此，以清除DPPH自由基能力、FRAP、清除ABTS+·能力為衡量指標(biāo)，酸法水解更適合作為青稞中結(jié)合酚的提取溶劑。

3 討 論

3.1 提取溶劑對(duì)青稞不同形態(tài)多酚提取效果及抗氧化活性的影響

由于不同植物的化學(xué)組成差異會(huì)導(dǎo)致不同植物中多酚的最適提取溶劑不同[12-13]，因此選取合適的溶劑從植物材料中提取酚類物質(zhì)是非常重要的，因?yàn)椴煌軇?duì)不同酚類物質(zhì)提取能力不同，因此其提取效率差異較大。本研究發(fā)現(xiàn)80%丙酮溶液較其他3 種溶劑具有較好的提取青稞全谷物中游離態(tài)總酚、總黃酮的能力，其提取液中含有較多的游離態(tài)單體多酚。此研究結(jié)果與Zhao Haifeng[19]、陸健[14]等的研究結(jié)果一致，其比較丙酮溶液、甲醇溶液、乙醇溶液及純水提取不同品種皮大麥中總酚、總黃酮等酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)丙酮溶液提取效果最好，且具有較強(qiáng)的DPPH自由基、ABTS+?、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力。然而申迎賓等[4]考察了水、60%乙醇溶液、60%甲醇溶液、60%丙酮溶液、60%乙醇溶液、100%甲醇、100%丙酮對(duì)不同品種青稞中總酚、總黃酮含量及抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)95%乙醇溶液和60%丙酮溶液更有利于青稞多酚的提取，且不同青稞品種中多酚含量及抗氧化活性對(duì)溶劑的選擇具有差異，60%乙醇溶液的提取液清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，60%丙酮溶液提取液具有最強(qiáng)的ABTS+?清除能力。分析原因可能是一方面由于不同濃度溶劑的極性不同，另一方面實(shí)驗(yàn)所選青稞的生長(zhǎng)環(huán)境及其品種的基因型影響其所含酚類物質(zhì)的含量，進(jìn)而影響其抗氧化活性。因此，不同提取溶劑對(duì)青稞中不同酚類物質(zhì)提取效率不同。

可食植物中天然存在的大部分多酚都是以游離或結(jié)合（與多糖或蛋白通過(guò)酯鍵和醚鍵）的形式存在[22]，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)谷物酚類化合物的研究多停留在游離酚層面，現(xiàn)在研究通過(guò)對(duì)谷物樣品進(jìn)行酸解、堿解、酶解等處理，可提取出其結(jié)合型酚類化合物，研究發(fā)現(xiàn)谷物中總酚含量與果蔬相當(dāng)或更高[1,31]，其中堿水解法被廣泛應(yīng)用于水解谷物等材料中的結(jié)合酚[20,32]。然而本研究發(fā)現(xiàn)酸法水解青稞全谷物中結(jié)合酚的總酚、總黃酮含量及抗氧化活性均顯著高于堿法水解物。這與徐菲等[18]報(bào)道的酸法更有利于釋放出青稞中的多酚類化合物的結(jié)果相一致。說(shuō)明酸法相對(duì)于堿法具有更強(qiáng)的提取青稞中結(jié)合態(tài)多酚的效果。

3.2 提取溶劑對(duì)青稞不同形態(tài)多酚單體組成的影響

不同提取溶劑體系影響青稞全谷物中游離酚及結(jié)合酚的組成與含量。本研究中參試青稞的80%丙酮溶液提取物中檢測(cè)到酚類物質(zhì)的組成種類明顯高于其他溶劑體系，且其提取液中總酚類化合物含量也最高，這與Zhao Haifeng等[19]報(bào)道的80%丙酮溶液提取的皮大麥中的總酚類物質(zhì)含量最高的結(jié)果相一致，但是報(bào)道中只檢測(cè)到9 個(gè)多酚單體化合物，兒茶素是皮大麥中主要的游離態(tài)多酚物質(zhì)。而本研究在丙酮溶液提取物中檢測(cè)到8～18 種多酚單體，明顯高于其報(bào)道的皮大麥中的多酚種類及含量，綠原酸與兒茶素是本實(shí)驗(yàn)青稞中游離酚的主要單體物質(zhì)，這與阿魏酸是大麥中主要的多酚物質(zhì)的報(bào)道也不同[29]。因此，青稞作為青藏高原的裸大麥，其多酚組成及含量與皮大麥存在顯著的差異。此外，已有報(bào)道比較了不同溶劑對(duì)荔枝果肉[20]、草莓[33]等提取物游離酚組成的影響，發(fā)現(xiàn)丙酮水提取物中酚類物質(zhì)種類最多，含量也較其他溶劑高。因此，本實(shí)驗(yàn)中80%丙酮溶液是一種高效提取青稞中游離酚類化合物的溶劑。

本實(shí)驗(yàn)中青稞結(jié)合酚酸法提取液中檢測(cè)到的單體酚類化合物種類（16～20）及含量明顯高于堿法提取液。沒(méi)食子酸、p-香豆酸、丁香酸、苯甲酸、藜蘆酸、橙皮苷是酸法水解青稞的主要結(jié)合酚種類。Nordkvist等[34]報(bào)道了大麥中結(jié)合態(tài)多酚主要為阿魏酸與p-香豆酸，而本實(shí)驗(yàn)中阿魏酸在青稞結(jié)合態(tài)提取物中的含量甚微，但同樣含有較高含量的p-香豆酸。這說(shuō)明p-香豆酸是皮大麥和裸大麥中共同含有的酚酸，而阿魏酸在皮大麥與青稞中含量差異較大。此外，已有報(bào)道稱荔枝果肉酸法水解的主要結(jié)合酚是表兒茶素和4-甲基兒茶酚[20]，說(shuō)明相同方法處理?xiàng)l件下的不同植物來(lái)源其結(jié)合酚種類不同。本實(shí)驗(yàn)中酸水解法較堿水解法有利于釋放出更多酚類物質(zhì)，但是酸法水解由于高溫也會(huì)損失一些羥基酸[20]。

4 結(jié) 論

提取溶劑的極性對(duì)青稞中不同形態(tài)多酚含量和抗氧化活性有顯著影響，且不同品種間存在差異。在4 種不同極性溶劑體系中，80%丙酮溶液提取青稞全谷物中游離態(tài)總酚、總黃酮含量最高，其抗氧化活性最強(qiáng)；酸水解法較堿水解法提取青稞中結(jié)合酚的提取效率高，抗氧化活性好。

不同溶劑對(duì)青稞中不同種類單體酚的富集及提取效果不同。80%丙酮溶液提取的青稞游離酚類物質(zhì)種類最多，不同溶劑對(duì)青稞中多酚組成的類別具有選擇性；酸法更有利于釋放出更多酚類物質(zhì)，是水解青稞結(jié)合酚的有效方法。

單體酚含量分析發(fā)現(xiàn)，綠原酸、苯甲酸、兒茶素、槲皮素、蘆丁是80%丙酮溶液提取青稞的主要游離態(tài)多酚種類，沒(méi)食子酸、p-香豆酸、丁香酸、苯甲酸、藜蘆酸、橙皮苷、丁香酸是酸法水解青稞的主要結(jié)合酚種類。阿魏酸、鄰香豆酸和楊梅素在青稞的游離態(tài)及結(jié)合態(tài)不同溶劑提取物中均具有相對(duì)較低的含量。選擇合適的提取溶劑對(duì)于評(píng)價(jià)青稞樣品的多酚含量和抗氧化能力非常重要，該結(jié)果為進(jìn)一步研究青稞全谷物中酚類物質(zhì)提供了一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)青稞中活性成分的開(kāi)發(fā)與利用具有參考意義。