鄭敏陽，詹萍萍，母昌考，王春琳，葉央芳*

（寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

蛻殼是甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的一個(gè)重要生命活動(dòng)，老的殼被蛻去，隨之新的殼被重建[1-2]。剛蛻殼的蟹被稱為軟殼蟹，因其方便食用、高鈣低脂等特性越來越受到消費(fèi)者青睞[3]。目前，已有多種蟹類被制作成軟殼蟹，包括雪蟹（Chinoecetes opilio）[4]、鋸緣青蟹（Scylla serrata）[5-6]、紅星梭子蟹（Portunus sanguinolentus）[7]和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）[3]等。Sudhakar等[7]發(fā)現(xiàn)紅星梭子蟹軟殼蟹的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類、礦物質(zhì)和氨基酸含量均低于硬殼蟹，軟殼蟹的營養(yǎng)價(jià)值不及硬殼蟹。而且，雪蟹和鋸緣青蟹軟殼蟹肌肉的蛋白質(zhì)含量也低于硬殼蟹[5]。盡管三疣梭子蟹軟殼蟹的蛋白質(zhì)和脂類含量也比硬殼蟹低，但氨基酸和脂肪酸水平卻與硬殼蟹相當(dāng)。值得關(guān)注的是，三疣梭子蟹軟殼蟹的鈣含量顯著高于硬殼蟹，因此軟殼蟹可能是一種補(bǔ)鈣佳品[3,8]。擬穴青蟹（Scylla paramamosain）是我國東南沿海重要的經(jīng)濟(jì)蟹類之一，因其味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高而廣受消費(fèi)者歡迎[9]，由其制作的軟殼蟹更是受到老人和孩子的喜愛。然而，擬穴青蟹軟殼蟹的營養(yǎng)價(jià)值是否低于硬殼蟹目前鮮見報(bào)道，因此，有必要對(duì)擬穴青蟹軟殼蟹和硬殼蟹之間的營養(yǎng)物質(zhì)組成差異進(jìn)行比較分析。

傳統(tǒng)的食品組分分析主要測(cè)定蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物等總量，隨著技術(shù)的發(fā)展，這種寬泛的組分分析方法已逐漸精細(xì)到有機(jī)小分子營養(yǎng)物（代謝物）的整體組成分析方法[10]。基于核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）的代謝組學(xué)技術(shù)正是定性和定量分析小分子代謝物的有力工具[11-12]，并已在蟹類腸道代謝物解析[13]、蟹類種類鑒別[14]、蟹糊級(jí)別鑒別[15]、蟹糊發(fā)酵過程中的質(zhì)量評(píng)價(jià)[16]以及蟹類在生理和病理?xiàng)l件下的代謝機(jī)理解析[17-18]中得到成功應(yīng)用。因此，本研究采用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)并結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析方法比較擬穴青蟹軟殼蟹與硬殼蟹肌肉和肝胰腺之間的營養(yǎng)物質(zhì)組成差異，為正確評(píng)估軟殼蟹的營養(yǎng)價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的擬穴青蟹硬殼蟹購自福建三門一水產(chǎn)交易市場(chǎng)，為獲得數(shù)量足夠的軟殼蟹，購買60 只硬殼的雄性青蟹，每只蟹質(zhì)量約250 g，分別單養(yǎng)在配備有循環(huán)水的蟹公寓中，鹽度控制在20‰～25‰。

甲醇、二水合磷酸二氫鈉、三水合磷酸氫二鉀（均為色譜純） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉（sodium 3-trimethylsilyl [2,2,3,3-2D4]propionate，TSP）、重水（99.9%氘代）（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司。

用50%重水溶液配制0.15 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4），內(nèi)含1.0×10－5g/mL TSP[19]。配制甲醇-水（2∶1，V/V）溶液作為組織胞內(nèi)物質(zhì)的提取液。

1.2 儀器與設(shè)備

Avance III 600 MHz核磁共振譜儀（配有超低溫探頭）德國Bruker Biospin公司；TD-XBYM組織破碎儀 北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司；5415R低溫高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；2.5 L冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

從硬殼蟹中隨機(jī)選取9 只青蟹作為硬殼蟹樣品，采集青蟹游泳足肌肉和肝胰腺各約500 mg，用液氮速凍后－20 ℃保存?zhèn)溆?。密切觀察青蟹蛻殼情況，并記錄每只青蟹的蛻殼時(shí)間，收集蛻殼時(shí)間為0 h和3 h的軟殼蟹各9 只，樣品處理方法同硬殼蟹。

1.3.2 營養(yǎng)物質(zhì)提取

為提取青蟹肌肉和肝胰腺組織中的胞內(nèi)物質(zhì)，先在每個(gè)樣品中分別加入1 mL甲醇提取液，然后置于組織破碎儀中，設(shè)置破碎頻率為20 Hz，破碎時(shí)間為90 s。所得提取物在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，以獲得上清液。殘?jiān)儆? mL甲醇提取液提取1 次。合并2 次提取所得的上清液，置于真空條件揮發(fā)上清液中的甲醇，進(jìn)一步冷凍干燥。在冷凍干燥粉中加入600 μL磷酸緩沖液，充分混勻，經(jīng)4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，將500 μL上清液移入直徑為5 mm的核磁管中，備用。

1.3.3 青蟹肌肉和肝胰腺提取物的NMR分析

在298 K條件下采集樣品的1H NMR譜，所用的脈沖序列是標(biāo)準(zhǔn)的NOESYGPPR1D：RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ，對(duì)應(yīng)的質(zhì)子共振頻率為600.13 MHz。為抑制水峰，設(shè)置等待時(shí)間為2 s，混合時(shí)間為100 ms，并施加強(qiáng)度約50 Hz的低功率連續(xù)波。對(duì)于每個(gè)1H NMR譜，均設(shè)置90°脈沖寬度約10 μs，譜寬為δ 20，采樣點(diǎn)數(shù)為32 K，自由感應(yīng)信號(hào)累加次數(shù)為64 次。把采集到的1H NMR譜的自由感應(yīng)信號(hào)先乘以增寬因子為0.5 Hz的指數(shù)窗函數(shù)，再進(jìn)行傅里葉變換，根據(jù)內(nèi)標(biāo)物TSP（δ 0.0）的化學(xué)位移，手動(dòng)定標(biāo)1H NMR譜，并作相位和基線校正。分別選擇一個(gè)具有肌肉和肝胰腺提取物典型1H NMR譜的樣品用于二維NMR譜采集，采集的二維NMR譜包括同核COSY和TOCSY譜，異核HSQC和HMBC譜。二維譜的實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置參見婁永江等[20]的方法。

1.3.4 NMR數(shù)據(jù)的多變量統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)樣品的1H NMR譜進(jìn)行分段積分，選取肌肉樣品的譜區(qū)間為δ 9.50～0.80，去除δ 5.00～4.70和δ 3.40～3.34的信號(hào)區(qū)間以消除水和甲醇的干擾；選取肝胰腺的譜區(qū)間為δ 9.70～0.75，去除水和甲醇的信號(hào)區(qū)間分別為δ 5.05～4.75和δ 3.37～3.34。所有1H NMR譜的積分區(qū)間均設(shè)置為2.4 Hz。為消除樣品之間的重量差異，對(duì)上述積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行了重量歸一化處理。把歸一化的NMR數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+軟件（V11.0，瑞典Umetrics公司），選擇標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)處理模式對(duì)NMR數(shù)據(jù)作主成分分析（principal component analysis，PCA），以獲得樣品的聚類情況。對(duì)不同蛻殼時(shí)間的軟殼蟹分別與硬殼蟹進(jìn)行兩兩比較的正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal projection to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA），在OPLS-DA中，先對(duì)1H NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)規(guī)格化處理，并設(shè)為X變量，把分組信息設(shè)為Y變量。采用8 倍交叉驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證的方差分析（cross validation-analysis of variance，CV-ANOVA）方法驗(yàn)證OPLS-DA模型的可靠性。OPLS-DA模型的Q2值越高且P值小于0.05，說明模型是可靠的[21]。再利用MATLAB軟件制作OPLS-DA模型的相關(guān)系數(shù)圖，以獲得導(dǎo)致兩組區(qū)分的具有顯著性意義的物質(zhì)。其中，以回溯轉(zhuǎn)換處理[22]的NMR數(shù)據(jù)作為X變量，以分組信息為Y變量，這2 個(gè)變量之間的皮爾森積差相關(guān)系數(shù)（r）值作為營養(yǎng)物質(zhì)在兩組間是否具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)，并以顏色代表其顯著性，顏色越暖（如紅色）表示顯著性越大，反之，顏色越冷（如藍(lán)色）表示顯著性越小。在本研究中，當(dāng)某一營養(yǎng)物質(zhì)的|r|大于0.632時(shí)，該物質(zhì)對(duì)組間區(qū)分達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

為獲得軟殼蟹與硬殼蟹的營養(yǎng)物質(zhì)差異，按下式計(jì)算不同時(shí)間采集的軟殼蟹的營養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)于硬殼蟹的相對(duì)變化率：

式中：Ci和C0分別為營養(yǎng)物質(zhì)在軟殼蟹和硬殼蟹中的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬穴青蟹肌肉和肝胰腺的營養(yǎng)物質(zhì)組成

圖1 擬穴青蟹肌肉和肝胰腺提取物的典型600 MHz 1H NMR譜Fig. 1 Typical 600 MHz 1H NMR spectra of the extracts of muscle and hepatopancreas of S. paramamosain

表1 擬穴青蟹肌肉和肝胰腺營養(yǎng)物質(zhì)的NMR數(shù)據(jù)Table 1 NMR data of nutrients detected in the muscle and hepatopancreas of S. paramamosain

續(xù)表1

NMR信號(hào)的歸屬依據(jù)參考文獻(xiàn)[23-24]及二維譜提供的氫氫相關(guān)和氫碳相關(guān)信息確定，NMR譜圖及代謝物NMR信息如圖1、表1所示。結(jié)果表明，擬穴青蟹肌肉和肝胰腺的營養(yǎng)物質(zhì)組成較類似，均含有相同種類的氨基酸、有機(jī)酸以及膽堿-O-硫酸、葡萄糖和2-吡啶甲醇。但這2 種組織仍有其特征性營養(yǎng)物質(zhì)信號(hào)，如海藻糖、延胡索酸、甲酸和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）只在肌肉中被檢測(cè)到，而肌氨酸、色氨酸和5’-三磷酸尿嘧啶（uridine 5’-triphosphate，UTP）只在肝胰腺中被檢測(cè)到。這種物質(zhì)組成的差異可能與其在組織中的生理功能密切相關(guān)。比較NMR譜還可以發(fā)現(xiàn)，與硬殼蟹相比，軟殼蟹肌肉含有較低水平的乳酸和5’-單磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，AMP），而其肝胰腺則含有較高水平的丙氨酸和較低水平的酪氨酸等。

2.2 軟殼蟹與硬殼蟹的營養(yǎng)物質(zhì)組成差異

圖2 擬穴青蟹肌肉和肝胰腺提取物的PCA得分圖Fig. 2 PCA scores plots of 1H NMR spectra of the extracts of muscle and hepatopancreas of S. paramamosain

為獲得軟殼蟹與硬殼蟹的營養(yǎng)物質(zhì)組成差異，首先采用非監(jiān)督的PCA方法對(duì)肌肉和肝胰腺NMR數(shù)據(jù)的分布進(jìn)行分析。如圖2所示，組織不同是導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)組成差異的主要原因（圖2A），但蛻殼也導(dǎo)致了肌肉營養(yǎng)物質(zhì)組成的輕微區(qū)分（圖2B）和肝胰腺營養(yǎng)物質(zhì)組成的明顯區(qū)分（圖2C）。

圖3 擬穴青蟹硬殼蟹與軟殼蟹肌肉和肝胰腺提取物的OPLS-DA得分圖和相關(guān)系數(shù)圖Fig. 3 OPLS-DA scores plots and corresponding color-coded correlation coefficient loadings plots

為進(jìn)一步提取軟殼蟹與硬殼蟹的物質(zhì)組成差異，對(duì)不同采集時(shí)間的軟殼蟹組織的NMR數(shù)據(jù)與硬殼蟹進(jìn)行了4 個(gè)OPLS-DA模型，如圖3所示，根據(jù)模型的Q2值和CV-ANOVA所得的P值，驗(yàn)證了這些模型都是可靠的。OPLS-DA結(jié)果表明，與硬殼蟹相比，0 h采集的軟殼蟹肌肉含有較低含量的乳酸、賴氨酸、精氨酸和三甲胺-N-氧化物（trimethylamine-N-oxide，TMAO）；而其肝胰腺則含有較高含量的亮氨酸和丙氨酸，同時(shí)含有較低含量的谷氨酸、甘氨酸、磷酸膽堿、甜菜堿和UTP。如果未能及時(shí)采集軟殼蟹，當(dāng)采集時(shí)間延遲到蛻殼后3 h時(shí)，則軟殼蟹肌肉含有更低含量的乳酸、精氨酸、TMAO、AMP和葫蘆巴堿；而肝胰腺中的谷氨酸、甘氨酸、磷酸膽堿和甜菜堿含量仍然低于硬殼蟹，丙氨酸含量仍然高于硬殼蟹，其他營養(yǎng)物質(zhì)包括組氨酸、酪氨酸、葡萄糖和未知物U1的含量也顯著低于硬殼蟹。

圖4 擬穴青蟹軟殼蟹相對(duì)于硬殼蟹的營養(yǎng)物質(zhì)變化Fig. 4 Variations in nutrients in soft-shell mud crabs relative to hard-shell mud crabs

如圖4所示，軟殼蟹肌肉中的乳酸和AMP含量下降較明顯，而且隨著采集時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇，在蛻殼后3 h時(shí)，已分別降低了57.6%和72.3%。而丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、焦谷氨酸和葫蘆巴堿含量都降低20%左右。軟殼蟹肝胰腺中產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)變化要比肌肉更復(fù)雜。丙氨酸含量在蛻殼0 h即增加到硬殼蟹的109.0%，在蛻殼3 h更是增加到硬殼蟹的138.7%。相反，谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、葡萄糖和甜菜堿含量都隨著蛻殼時(shí)間的延長(zhǎng)呈快速降低的趨勢(shì)，下降最明顯的是谷氨酰胺，在剛蛻殼后下降了硬殼蟹水平的46.8%，在蛻殼3 h下降了硬殼蟹水平的82.0%。

肌肉組織是擬穴青蟹的主要可食用部位，其營養(yǎng)物質(zhì)組成差異對(duì)青蟹的質(zhì)量起著主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果表明，剛剛蛻殼的軟殼蟹肌肉中只有4 種營養(yǎng)物質(zhì)即乳酸、賴氨酸、精氨酸和TMAO的含量顯著下降，盡管賴氨酸是必需氨基酸，但精氨酸是非必需氨基酸，而且這2 個(gè)氨基酸對(duì)呈味的影響較小，因此，這2 個(gè)氨基酸含量的降低可能對(duì)青蟹肌肉的質(zhì)量影響較小。乳酸呈柔和的酸味[25]，顯著降低的乳酸含量可能只是減少了肌肉的酸味。事實(shí)上，在這4 個(gè)顯著變化的營養(yǎng)物質(zhì)中，最值得關(guān)注的是TMAO。盡管TMAO對(duì)維持海洋生物組織的滲透平衡起著重要作用[26]，但人類食用了含有TMAO的海洋生物如魚類，可能會(huì)導(dǎo)致血液中TMAO水平升高[27]，從而提高患動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[28]。擬穴青蟹蛻殼后，TMAO含量顯著下降，這可能預(yù)示著人們患動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)降低，但減少的TMAO可能在細(xì)菌或酶的作用下已降解成為有害物質(zhì)三甲胺（trimethylamine，TMA）[29-30]，因?yàn)門MA進(jìn)入人體肝臟后同樣會(huì)被黃素單加氧酶轉(zhuǎn)化成為TMAO[28]。但本研究并未檢測(cè)到TMA，說明TMA在肌肉中的含量低于NMR檢測(cè)限或甚至為0，但擬穴青蟹肌肉中TMAO的分解值得以后進(jìn)一步研究。

盡管肌肉是主要的食用部位，但肝胰腺卻是消費(fèi)者評(píng)價(jià)青蟹品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵，因?yàn)橄M(fèi)者的評(píng)價(jià)依據(jù)是肝胰腺的色澤。但在營養(yǎng)學(xué)家眼里，客觀的營養(yǎng)物質(zhì)組成才是食品品質(zhì)的決定因素。在新蛻殼的青蟹肝胰腺中，顯著提高的有亮氨酸和丙氨酸，顯著下降的有谷氨酸和甘氨酸。亮氨酸是必需氨基酸，丙氨酸、谷氨酸和甘氨酸是非必需氨基酸。從滋味角度，丙氨酸和甘氨酸帶有甜味，谷氨酸呈鮮味，而亮氨酸呈苦味[25]。這些氨基酸含量的波動(dòng)加上顯著降低的甜菜堿含量可能會(huì)影響軟殼蟹肝胰腺的最終滋味。

如果擬穴青蟹蛻殼后未能及時(shí)采集，肌肉和肝胰腺的營養(yǎng)物質(zhì)組成變化將進(jìn)一步加劇。肌肉中有5 種營養(yǎng)物質(zhì)即乳酸、精氨酸、TMAO、AMP和葫蘆巴堿的含量顯著降低，其中，AMP可賦予肌肉鮮味[25,31]，降低的AMP含量可能影響軟殼蟹肌肉的鮮度。與肌肉相比，延遲采集對(duì)肝胰腺營養(yǎng)物質(zhì)的影響更大，有更多的營養(yǎng)物質(zhì)如組氨酸、酪氨酸和葡萄糖含量均顯著降低，組氨酸、酪氨酸呈苦味，但葡萄糖提供甜味，更重要的是這些物質(zhì)都是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，延遲采集將可能影響擬穴青蟹軟殼蟹的品質(zhì)和風(fēng)味。

3 結(jié) 論

本研究利用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)，比較分析擬穴青蟹軟殼蟹與硬殼蟹之間的小分子營養(yǎng)物質(zhì)組成差異。與硬殼蟹相比，剛蛻殼的軟殼蟹肌肉中只有賴氨酸、精氨酸、乳酸和TMAO含量發(fā)生了顯著下降，可能對(duì)軟殼蟹肌肉的營養(yǎng)價(jià)值和口感影響較小，但TMAO含量的顯著下降可能降低了人們患病的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，在剛蛻殼的軟殼蟹肝胰腺中，4 種氨基酸和甜菜堿含量的顯著波動(dòng)可能影響了肝胰腺的滋味。如果擬穴青蟹蛻殼后未能及時(shí)采集，蛻殼后3 h的軟殼蟹肌肉和肝胰腺的營養(yǎng)物質(zhì)組成變化將進(jìn)一步加劇。特別是軟殼蟹肌肉中的AMP水平開始呈顯著下降，這可能影響肌肉的鮮度；而肝胰腺中的組氨酸、酪氨酸和葡萄糖含量也開始呈顯著降低，可能影響肝胰腺的營養(yǎng)價(jià)值。因此，從小分子營養(yǎng)物質(zhì)水平來看，剛蛻殼的擬穴青蟹軟殼蟹可比擬于硬殼蟹，而且可能是一種更健康的水產(chǎn)品，但延遲采集軟殼蟹將會(huì)影響青蟹軟殼蟹的品質(zhì)和口感。本研究結(jié)果可為擬穴青蟹軟殼蟹的采集和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。