高 媛，王 蒙，王 瑤，呂曉玲，馮曉元,*

（1.北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室（北京），北京 100097；2.鄞州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 寧波 315192）

蔬菜在我國居民膳食中的食物構(gòu)成比高達(dá)33.7%[1]。大量流行病學(xué)研究顯示，經(jīng)常食用水果蔬菜可以有效降低多種疾病的發(fā)生率，果蔬中富含酚類物質(zhì)是重要原因[2]。酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗癌、提高免疫力等生物活性[3-4]。酚酸是酚類物質(zhì)中的一類，約占植物源食品中酚類化合物的三分之一，多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物。研究表明酚酸還與采后運(yùn)輸、貯藏、誘導(dǎo)抗性及果實(shí)色澤和風(fēng)味等品質(zhì)指標(biāo)密切相關(guān)[5-6]。水果、蔬菜、谷物、豆類等都是很好的酚酸來源[7-8]。酚酸的種類和含量因地理環(huán)境、氣候條件、栽培措施、提取方法等的不同有所差異[9-10]。

酚酸存在形式復(fù)雜，有游離型、游離酯型和結(jié)合型（不可溶）3 種存在形式。其中，游離酯型和結(jié)合型酚酸多以酯鍵、醚鍵等與其他物質(zhì)（包括纖維素、多肽、蛋白質(zhì)、糖、有機(jī)酸等）相結(jié)合[11]，需經(jīng)水解釋放出來才能被測定。不同植物中酚酸的種類和含量均有所不同。目前已有番茄[12]、馬鈴薯[9]、茄子[13]、胡蘿卜[14]、白菜[15-16]、苦瓜[17]中酚酸含量的報道。其中，綠原酸是研究較為廣泛的酚酸類物質(zhì)之一，在番茄和馬鈴薯中含量豐富；此外，也有關(guān)于阿魏酸、咖啡酸、芥子酸、對香豆酸等的報道，但研究多集中于游離型酚酸。不同形態(tài)的酚酸在多種水果[18-19]、谷物麩皮[20]等中得到鑒定，但在蔬菜中關(guān)注較少，尤其對于游離酯型和結(jié)合型酚酸鮮見相關(guān)報道。游離酯型酚酸在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均證明有較強(qiáng)的抗氧化活性[19,21]，且研究表明酯型和結(jié)合型酚酸可以與細(xì)胞壁相結(jié)合，作用于消化道，經(jīng)酶解釋放出生物活性物質(zhì)，可以預(yù)防結(jié)腸癌等慢性疾病[22]。因此，全面分析蔬菜中酚酸的分布、存在形式具有重要意義。

本研究利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對10 種蔬菜及其制品，包括豇豆、西蘭花、黃豆芽、茄子、番茄、黃瓜、菠菜、白菜、馬鈴薯和番茄醬中的游離型、游離酯型和結(jié)合型酚酸含量進(jìn)行測定和分析，以期為蔬菜中酚酸類物質(zhì)生物活性的研究提供數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 種蔬菜，包括豇豆（Vigna unguiculata cylindrica）、西蘭花（Brassica oleracea L. var. italic Planch.）、黃豆芽、茄子（Solanum melongena L.）、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）、黃瓜（Cucumis sativus L.）、菠菜（Spinacia oleracea L.）、白菜（Brassica pekinensis）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）和番茄醬，均購自北京地區(qū)超市。樣品采集日期為同一天（2017年9月15日），共選取了3 個代表性采樣點(diǎn)，分別為果香四溢蔬菜市場、家樂福超市和沃爾瑪超市，每個超市采集10 種蔬菜樣品各1.5～2 kg，樣品運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室后，將3 份樣品混合為一份樣品。樣品混合完成后，將非可食用部分除去，切成8～10 mm的小塊，在液氮保護(hù)下研磨成粉末，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酚酸標(biāo)準(zhǔn)品新綠原酸、綠原酸、沒食子酸、4-羥基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、異阿魏酸、鞣花酸、水楊酸和肉桂酸（純度均大于97%） 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜級） 美國Fisher公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純） 北京化學(xué)試劑公司；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTM超高效液相色譜儀-TQS串聯(lián)質(zhì)譜儀、電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）接口 美國Waters公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；A11分析研磨機(jī)、KS260搖床 德國IKA公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國Mimpore公司；N-EVA-112P氮吹儀 美國Organomation公司；pHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；3-30k臺式高速離心機(jī) 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Acquity HSS C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫45 ℃；樣品室溫度10 ℃，進(jìn)樣體積5 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液；流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫條件：初始流動相A為95%，保持0.5 min，4.5 min內(nèi)降至70%，隨后在4.5 min內(nèi)降至10%，保持0.5 min后在0.5 min內(nèi)升至95%，保持2.5 min；流速0.3 mL/min；總運(yùn)行時間13 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源模式采用正負(fù)離子模式（ESI+和ESI－）；毛細(xì)管電壓2.5 kV（ESI+）/－1.5 kV（ESI－）；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；去溶劑氣流量1 000 L/h；錐孔氣流速150 L/h。采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，14 種酚酸的MRM參數(shù)見表1。

表1 14 種酚酸的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM parameters for 14 phenolic acids

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取14 種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，配制成1 mg/mL的酚酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20 ℃保存。酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液采用梯度稀釋法現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 酚酸類物質(zhì)的提取

1.3.4.1 游離型酚酸

參照本實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的方法，作適當(dāng)改動[23]。取10 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇提取液（含1%鹽酸），渦旋振蕩10 s，室溫條件下超聲提取20 min，10 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。重復(fù)上述步驟1 次，合并上清液，定容至50 mL。混勻后過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待上機(jī)。游離型酚酸含量以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.4.2 游離酯型酚酸

參考Li Li等[24]的方法并作適當(dāng)修改。取10 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 80%甲醇提取液（含1%鹽酸），渦旋，室溫條件下超聲提取20 min，10 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶。重復(fù)上述步驟1 次，合并上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至15 mL以內(nèi)。轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中，加入20 mL 4 mol/L NaOH溶液，充入N2，40 ℃氣浴振蕩避光水解2 h，之后用濃HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2，加入20 mL正己烷，室溫振蕩20 min，去除正己烷層。20 mL乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35 ℃減壓濃縮至盡干，用10 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶解，混勻過0.22 μm有機(jī)相濾膜，備用。該提取方法中，游離型和游離酯型酚酸均被乙酸乙酯萃取，因此游離酯型酚酸含量為檢測結(jié)果減去1.3.4.1節(jié)中對應(yīng)游離型酚酸的數(shù)據(jù)。游離酯型酚酸含量以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.4.3 結(jié)合型酚酸

取1.3.4.2節(jié)離心后剩余的殘?jiān)尤?0 mL 4 mol/L NaOH溶液，充入N2，40 ℃氣浴振蕩，避光水解2 h，濃HCl調(diào)節(jié)pH值至2。用20 mL乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35 ℃減壓濃縮至盡干，用10 mL體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液溶解，混勻過0.22 μm有機(jī)相濾膜，備用。結(jié)合型酚酸含量以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.5 定量分析

將1.3.3節(jié)中配制的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次逐級稀釋，配制成一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照測定條件進(jìn)行分析。以峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。樣品分析采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

不同蔬菜樣品酚酸類物質(zhì)主成分分析利用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站（http://www.metaboanalyst.ca/）完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔬菜及其制品中的游離型酚酸測定結(jié)果

表2 10 種蔬菜及其制品中游離型酚酸含量Table 2 Free phenolic acid contents of ten vegetables and vegetable product mg/kg

酚酸根據(jù)物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，可以分為羥基苯甲酸類和羥基肉桂酸類。如表2所示，共檢出游離型酚酸7 種，均為羥基肉桂酸類，包括新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸和鞣花酸。除馬鈴薯外，鞣花酸在其他9 種蔬菜及其制品中均有檢出，且對于游離型酚酸，西蘭花、黃豆芽和黃瓜中，僅有鞣花酸檢出。芥子酸僅在白菜中有檢出，且含量較高（19.30 mg/kg），可占白菜中游離型酚酸總量的70%以上。新綠原酸僅在番茄、白菜和馬鈴薯中檢測到。游離型酚酸總量在白菜中含量最高，其次為馬鈴薯。Seong等[16]測定了白菜不同部位的酚酸含量，結(jié)果表明芥子酸在酚酸總量中所占比例最大。馬鈴薯中游離型酚酸以綠原酸為主，含量與文獻(xiàn)報道相符[9,25]；其次為新綠原酸，其含量與Akyol等[9]報道相符，低于Furrer等[25]報道的含量，可能是由于檢測方法不一致造成的[10]。茄子中也含有較高含量的綠原酸，研究表明酚酸含量可能會由于基因型、環(huán)境、地理因素、提取條件的不同而有所差異[10,12,26]。

2.2 蔬菜及其制品中的游離酯型酚酸測定結(jié)果

如表3所示，其中羥基苯甲酸類3 種，包括4-羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸；羥基肉桂酸類6 種，包括咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、異阿魏酸和肉桂酸。結(jié)果表明，對于大部分蔬菜（除茄子、白菜、馬鈴薯外），游離酯型酚酸在3 種存在形式中含量最高，所占比例最大，這與文獻(xiàn)[8,23]報道的結(jié)果一致。從種類上看，10 種蔬菜中均檢測到4-羥基苯甲酸、對香豆酸和阿魏酸；且除黃豆芽和黃瓜外，其余8 種蔬菜也檢測到異阿魏酸。從含量上看，豇豆中酚酸總量最高，其次是菠菜。豇豆、黃豆芽、茄子、黃瓜、菠菜中的游離酯型酚酸以對香豆酸為主，其中豇豆中的對香豆酸含量高于其他種類蔬菜，可占其游離酯型酚酸總量的80%左右。西蘭花和馬鈴薯中則以阿魏酸所占比例最高。阿魏酸在植物中廣泛存在，在植物細(xì)胞壁中主要與碳水化合物通過酯鍵相連，與木質(zhì)素通過醚鍵相連，作為“橋梁”將木質(zhì)素與碳水化合物連接在一起[25]；研究表明阿魏酸在谷物、干豆及多種蔬菜中含量豐富[27]。10 種蔬菜中菠菜的阿魏酸含量最高（27.29 mg/kg），其次為西蘭花（17.88 mg/kg），黃瓜中含量最低（0.31 mg/kg）。番茄和番茄醬中的游離酯型酚酸以咖啡酸含量最高，而白菜中芥子酸所占比例最大，且含量高于其他種類蔬菜。

表3 10 種蔬菜及其制品中游離酯型酚酸含量Table 3 Conjugated phenolic acid contents of ten vegetables and vegetable productsmg/kg

游離酯型酚酸是一種可通過甲醇溶液直接提取的可溶性成分，但與可溶性糖、多肽等通過酯鍵或者醚鍵相連，需通過水解才能釋放出來[28-29]。有研究表明，絕大多數(shù)的酚酸在堿性條件下更容易水解，而酸性條件則不利于酚酸的釋放[8,19]。不同形態(tài)的酚酸在蜜橘[18]、谷物麩皮[20]等中得到分析，但在蔬菜中對于不同形態(tài)酚酸的測定鮮見報道。傳統(tǒng)的分析方法通過直接提取分析，只能得到游離型酚酸，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不全面[30-31]。蔬菜中的酚酸多以酯化形式存在[8]，更加全面的測定方法能更好地解釋其抗氧化特性及營養(yǎng)價值。

2.3 蔬菜及其制品中的結(jié)合型酚酸測定結(jié)果

結(jié)合型酚酸與細(xì)胞壁多糖、木質(zhì)素通過酯鍵或醚鍵相連，不能直接被甲醇溶液提取，是不可溶性酚酸，在堿性條件下水解可釋放出來。如表4所示，10 種蔬菜及制品中共檢出結(jié)合型酚酸8 種，其中羥基苯甲酸類3 種，包括4-羥基苯甲酸、香草酸和丁香酸；羥基肉桂酸類5 種，包括咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸和異阿魏酸。10 種蔬菜中均檢測到阿魏酸，但含量差異較大，菠菜中結(jié)合型阿魏酸含量（10.17 mg/kg）遠(yuǎn)高于其他種類蔬菜，此外阿魏酸也是白菜和馬鈴薯中檢出的唯一一種結(jié)合型酚酸。除白菜和馬鈴薯外其他8 種蔬菜中均有對香豆酸檢出。咖啡酸僅在豇豆和茄子中有檢出；香草酸和丁香酸僅在黃豆芽中檢出，10 種蔬菜及制品中，芥子酸僅存在于西蘭花中；異阿魏酸在菠菜中有較高的含量，在豇豆和西蘭花中也有少量檢出。結(jié)合型酚酸總量在菠菜中含量最高（20.32 mg/kg），馬鈴薯和白菜中含量較低。阿魏酸是菠菜中最主要的結(jié)合型酚酸，約占結(jié)合型酚酸總量的50%，其次為異阿魏酸（8.66 mg/kg）。目前鮮見以上10 種蔬菜中結(jié)合型酚酸含量的文獻(xiàn)報道。游離酯型酚酸和結(jié)合型酚酸在植物抗氧化性作用中發(fā)揮重要作用[28,32]，因此，全面分析酚酸的含量及存在形式，可為其生物活性包括對健康的影響等提供更加科學(xué)和系統(tǒng)的評估。

表4 10 種蔬菜及其制品中結(jié)合型酚酸含量Table 4 Bound phenolic acid contents of ten vegetables and vegetable products mg/kg

2.4 主成分分析

圖1 10 種蔬菜及其制品中酚酸類物質(zhì)主成分分析Fig. 1 Scatter plots and loading plots from the PCA of different forms of phenolic acids

圖1反映了不同種類蔬菜與酚酸類物質(zhì)之間的對應(yīng)關(guān)系。從圖1a可以看出，大部分蔬菜樣品可以較好地區(qū)分開。前2 個主成分解釋了總方差的91.1%，其中第1主成分占總方差的80.3%，除豇豆和菠菜外，其他蔬菜樣品分布在第1主成分的正半軸。第2主成分占總變量的10.8%，除菠菜、西蘭花、白菜和黃豆芽外，其他樣品分布在第2主成分的負(fù)半軸。從圖1b可以看出，酚酸類物質(zhì)處于橫坐標(biāo)負(fù)半軸的居多。其中，茄子、番茄、馬鈴薯和番茄醬在得分散點(diǎn)圖中距離較近，表明酚酸差異相對較小，結(jié)合載荷圖發(fā)現(xiàn)，與其他蔬菜相比，綠原酸和咖啡酸含量相對較高。豇豆位于第1主成分的負(fù)半軸，且與其他樣品距離較遠(yuǎn)，結(jié)合載荷圖，其對香豆酸含量遠(yuǎn)高于其他種類蔬菜，是區(qū)別于其他樣品的特征性物質(zhì)；而阿魏酸和異阿魏酸是菠菜的特征性組分；西蘭花中也含有較高含量的阿魏酸；芥子酸是白菜中的特征性物質(zhì)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS對10 種蔬菜及制品中不同形態(tài)酚酸（包括游離型、游離酯型和結(jié)合型）進(jìn)行測定，結(jié)果表明不同蔬菜樣品間酚酸種類和含量差異很大。白菜中游離型酚酸總量最高；游離酯型酚酸以豇豆中含量最高，其次為菠菜；結(jié)合型酚酸在菠菜中含量最高。主成分分析結(jié)果表明，對香豆酸是豇豆區(qū)別于其他種類蔬菜的特征性物質(zhì)，芥子酸在白菜中有較高的含量，而阿魏酸和異阿魏酸是菠菜的特征性組分。本研究可為果蔬不同形態(tài)酚酸組分的鑒定及功能性產(chǎn)品的開發(fā)利用提供一定的參考價值。