陳文炳，繆婷玉，翁國柱，陳融斌，邵碧英，彭 娟，江樹勛

（1.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，福建 福州 350001；2.莆田出入境檢驗檢疫局，福建 莆田 351100；3.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021）

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增技術在食品動物成分鑒別中已得到廣泛應用[1-4]，早期DNA條形碼是指通過PCR擴增與測序獲得的長度適當?shù)木€粒體細胞色素C氧化酶亞基I（mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I，CO I）基因的DNA片段[5]，其間堿基序列在物種間遺傳變異較大，而在種內(nèi)遺傳變異小，相對穩(wěn)定。近年來，被作為DNA條形碼的不僅限于CO I基因，包括基于16S rRNA和線粒體細胞色素b（cytochrome b，Cyt b）基因的DNA條形碼，都已被廣泛應用于魚類物種鑒別[6-18]。在河豚魚物種分化分子生物學研究領域，陳超等[19]應用隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplification of polymorphic DNA，RAPD）標記技術對4種東方鲀屬河豚魚進行系統(tǒng)關系的研究分析。邵愛華等[20-24]以暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus）為研究材料，對16S rRNA基因、Cyt b基因及CO I、CO II、CO III 3 種亞基等進行了一系列的序列分析研究。本課題組前期建立并優(yōu)化了河豚魚物種成分的PCR檢測方法[25]，以及對河豚魚的Cyt b與16S rRNA的靶基因序列進行同源性分析[26-27]，探討物種間的親緣關系，并對基于芯片生物分析系統(tǒng)[28]與限制性內(nèi)切酶確證河豚魚物種成分PCR檢測結(jié)果等進行了一系列探討[29]。

本實驗利用13 個已知物種名稱的河豚魚CO I基因靶序列進行序列同源性比對分析，建立樣品間的系統(tǒng)關系樹，并將9 個未知種名的河豚魚樣品與13 個已知物種名稱的CO I基因靶序列進行同源性比對分析，為基于CO I基因的DNA條形碼技術在河豚魚物種鑒定中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表1 22 個河豚魚供試樣品Table 1 Twenty two samples of puffer fishes tested in this study

已知物種名稱的河豚魚樣品11 個來自福建莆田、廈門等水產(chǎn)養(yǎng)殖場，2 個來自福建省集美大學水產(chǎn)學院近海捕撈；5 個未知物種河豚魚干樣品來自福建福州沿海，4 個未知物種新鮮個體來自海南?。ū?）。

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB） 上海博亞生物技術有限公司；2×Taq PCR Master Mix、蛋白酶K、DNA Marker I 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖 英國Oxoid公司；CO I基因PCR擴增通用引物根據(jù)文獻[30]進行序列修改，正向CO I A：5’-GGCGTATGCGTCTGGGTAGTC-3’，反向CO I F：5’-CCTGCAGGAGGAGGAGATCC-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析儀 瑞典Amersham公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國Biometra公司；Power Pac 1000電泳儀 美國Bio-Rad公司； GL212 PRO凝膠成像儀 美國Carestream公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與PCR擴增

DNA提取方法與PCR擴增參照文獻[25]。取鮮肉或干樣50 mg加入CTAB裂解液后在超聲波環(huán)境中65 ℃溫育處理30 min，進行DNA提取、PCR產(chǎn)物電泳，并拍照保存。

1.3.2 DNA堿基序列測定、比對、同源性分析

PCR擴增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，DNA序列用DNAMAN V6分析軟件進行整理分析，以.seq格式輸出，并對各個樣品的DNA序列進行比對與同源性分析，比對結(jié)果以MASED Document/DNAMAN1格式輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO I基因序列分析與比對

表2 河豚魚的CO I基因PCR產(chǎn)物堿基序列的基本信息Table 2 Information about partial sequences of the CO I gene from puffer fish

對CO I基因PCR擴增引物進行擴增，獲得的PCR產(chǎn)物進行測序，片段大小為681 bp，堿基序列基本信息與基因庫（GenBank）登錄號見表2。堿基序列同源性分析結(jié)果表明，13 個已知種名的河豚魚樣品堿基序列差別主要表現(xiàn)在單個堿基的置換。

2.2 序列同源性分析

圖1 13 個已知種名河豚魚的CO I部分基因PCR產(chǎn)物堿基序列同源樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on CO I sequence homology among 13 known species

13 個已知種名的河豚魚樣品間同源率為84%～100%（圖1），可歸為4組，第I組含兔頭鲀屬的黑腮兔頭鲀與兔頭鲀2個種及蟲紋東方鲀，同源率為100%；第II組月腹刺鲀，與第I組同源率87%，第III組含腹刺鲀屬的棕斑腹刺鲀、暗鰭腹刺鲀2 個種，同源率為90%，與I組、II組間同源率86%，第IV組含東方鲀屬的7個種，同源率在95%～100%之間。CO I部分基因PCR產(chǎn)物堿基序列同源性分析結(jié)果，除蟲紋東方鲀歸到兔頭鲀屬外，其他物種劃分與形態(tài)學物種分類較為吻合，但是，物種間同源率達到100%，不利于作為物種鑒別的指標，因此有必要通過其他基因作為輔助組合，加以判斷。

2.3 未知種名河豚魚樣品的種屬

CO I基因部分片段的PCR產(chǎn)物序列同源性聚類分析結(jié)果顯示（圖2），包括9 個未知種名的樣品，22 個供試樣品可分為4 個組，其中9 個未知種名的樣品被歸類到3 個類群組中，分別屬于東方鲀屬和腹刺鲀屬2 個屬。無未知種名樣品歸到I組；HNW2歸到II組，與月腹刺鲀同源率100%；HNW3、HNW4、FJW2、FJW5、HNW1共5個樣品歸到第III組（腹刺鲀屬），其中HNW3、HNW4、FJW2、FJW5與棕斑腹刺鲀同源率為100%，HNW1與暗鰭腹刺鲀同源率100%；FJW1、FJW3、FJW4 3個樣品歸到第IV組，與橫紋東方鲀同源率均為100%。

根據(jù)上述分析結(jié)果判定，9 個未知種名的樣品中，1 個樣品（HNW2）為月腹刺鲀，4 個樣品（HNW3、HNW4、FJW2、FJW5）為棕斑腹刺鲀，1 個樣品（HNW1）為暗鰭腹刺鲀，3 個樣品（FJW1、FJW3、FJW4）為橫紋東方鲀。該結(jié)果與筆者基于同樣河豚魚13 個樣品的Cyt b基因部分序列（使用的XBssb引物[31]：正向：5’-GGCGTGAAAAACCATCGTTG-3’，反向：5’-CCCCGACATTCGGTTTACAAGAC-3’）聚類分析結(jié)果（未發(fā)表）高度吻合（圖3），圖3中除FJW2樣品與棕斑腹刺鲀同源率為96%以外，其他8個樣品歸類結(jié)果與本實驗聚類分析結(jié)果（圖2）完全一致。

圖2 已知種名與未知種名河豚魚的CO I部分基因PCR產(chǎn)物堿基序列同源樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on CO I sequence homology between known and unknown species

圖3 13 個已知種名與9 個未知種名的河豚魚樣品Cyt b（XBssb引物）部分基因PCR產(chǎn)物序列同源樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on Cyt b sequence (using XBssb primers)homology between known and unknown species

3 結(jié)論與討論

本實驗獲得的3 屬13 種河豚魚樣品的CO I基因部分片段DNA堿基序列共13 條，提交GenBank，取得相應的登錄號（表2）。探討了CO I基因部分序列的DNA條形碼技術在河豚魚種屬鑒別中應用的可能性。根據(jù)DNA條形碼序列聚類分析，判定了9 個未知種名的河豚魚樣品所屬的物種，其中，HNW2為月腹刺鲀，HNW3、HNW4、FJW2、FJW5均為棕斑腹刺鲀，HNW1為暗鰭腹刺鲀，F(xiàn)JW1、FJW3、FJW4為橫紋東方鲀。該結(jié)果在XBssb引物[23]對同樣河豚魚樣品的Cyt b基因部分序列進行PCR擴增獲得的序列聚類分析結(jié)果（圖3）中得到驗證。另外，本實驗對已知種屬的樣品分類與未知樣品的種屬判定結(jié)果也比筆者之前基于另一個Cyt b基因片段部分DNA序列[26]及16S rRNA基因部分DNA序列的分類結(jié)果[27]更接近形態(tài)學分類、更合理?？梢姳緦嶒炦x擇的CO I基因的DNA片段序列是比較理想的河豚魚物種歸類的鑒定指標，可以用于河豚魚種屬鑒定。13號樣品蟲紋東方鲀在16S rRNA[27]、Cyt b基因（圖3）及本研究CO I基因的DNA片段序列的同源性聚類分析結(jié)果，都是與兔頭鲀屬歸為一組，且同源率達99%～100%，可能形態(tài)學分類上存在誤差，此問題有待進一步探討。