石吉勇，吳勝斌，鄒小波*，張 芳，趙 號(hào)，李文亭

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

益生菌是指宿主攝入一定量后對(duì)宿主產(chǎn)生保健作用的一類活性有益微生物[1-2]。研究表明，酸奶中的益生菌進(jìn)入腸道后，具有改善腸道正常菌群、抗癌抗腫瘤、增強(qiáng)人體自身免疫力等重要功效[3-5]。目前市面上常見的功能性酸奶中含有的菌種主要有保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌等。其中，干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌為常見的益生菌種，而保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在酸奶中主要起發(fā)酵作用[6-7]，屬于發(fā)酵菌種，難以通過胃部進(jìn)入腸道正常的生長(zhǎng)繁殖，不能發(fā)揮其保健功能。因此開發(fā)一種酸奶中益生菌的簡(jiǎn)單、快速、高效的鑒別計(jì)數(shù)方法對(duì)于維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益和保障食品安全具有重要意義。

傳統(tǒng)鑒別計(jì)數(shù)食品中微生物的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒別計(jì)數(shù)法[8-9]、分子生物學(xué)定量法[10-12]、機(jī)器視覺法[13-16]等。形態(tài)學(xué)鑒別計(jì)數(shù)法主要是通過染色、鏡檢等方法獲取特定微生物的培養(yǎng)形態(tài)及特征進(jìn)行檢測(cè)，具有直觀、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、操作繁瑣。分子生物學(xué)定量法是從微生物的基因水平上進(jìn)行鑒別，其優(yōu)點(diǎn)是精確、高效，但該方法局限性較大，如操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、試劑昂貴等。機(jī)器視覺技術(shù)是近些年來興起的一種基于視覺算法的新興計(jì)數(shù)，該方法主要是通過微生物紋理、顏色等特征信息，從形態(tài)學(xué)角度進(jìn)行一系列的處理以達(dá)到分割計(jì)數(shù)的效果，具有簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在較大的缺陷，如對(duì)于光照、相機(jī)、算法要求較高等。

高光成像技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的光譜分析技術(shù)與圖像分析技術(shù)于一體，能夠同時(shí)捕獲樣本的光譜信息與空間位置信息，是近些年來在食品品質(zhì)安全監(jiān)測(cè)應(yīng)用中新興的一門快速無損檢測(cè)技術(shù)[17]。菌落在生長(zhǎng)繁殖過程中，外部結(jié)構(gòu)（形狀、紋理）和內(nèi)部結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)、成分）均會(huì)發(fā)生一定的改變[18]。高光譜對(duì)菌落內(nèi)部含氫基團(tuán)較為敏感[19]，由于不同菌種具有不同內(nèi)部組分含量，因此可通過提取圖像中像素點(diǎn)的光譜信息以達(dá)到鑒別及計(jì)數(shù)的目的，然而利用高光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)益生菌酸奶中益生菌的鑒別計(jì)數(shù)研究鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采用高光譜技術(shù)對(duì)益生菌酸奶中各類益生菌進(jìn)行鑒別及計(jì)數(shù)，解決混合發(fā)酵益生菌酸奶中多種益生菌同時(shí)存在的情況下對(duì)每種益生菌數(shù)量計(jì)數(shù)的難題，為快速、無損判斷各類益生菌酸奶益生功能活性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種：實(shí)驗(yàn)所用菌株保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacillu caseii）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)所用MRS培養(yǎng)基參照GB 4789.35—2016《食品微生物檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》附錄A規(guī)定制備，MC培養(yǎng)基配方參照GB 4789.35—2016，LC培養(yǎng)基的配制參考文獻(xiàn)[20]方法，麥芽糖-MRS培養(yǎng)基和山梨醇-MRS培養(yǎng)基的制備參照文獻(xiàn)[21]，MRS和AC培養(yǎng)基的配制按照文獻(xiàn)[22]方法。

1.2 儀器與設(shè)備

高光譜圖像采集系統(tǒng)由江蘇大學(xué)組裝搭建[23]，主要零部件包括高光譜攝像機(jī)（ImSpector，V10E，芬蘭）、150 W的光纖鹵素?zé)簦‵iber-Lite DC950Illuminator，DolanJenner Industries Inc，MA，美國(guó)）、精密電控移動(dòng)平臺(tái)（Zolix，SC30021A，北京）、軟件系統(tǒng)為SpectralCube軟件（芬蘭Spectral Imaging有限公司提供）、光譜提取軟件為ENVI 4.5（V.4.5，Research System Inc boulder CO. USA）。

LD-2A離心機(jī) 北京京力離心機(jī)有限公司；HI 2214 ORP Meter 2011 pH計(jì) 哈納儀器有限公司；GHP-9050隔水式培養(yǎng)箱 上海合恒儀器設(shè)備有限公司；HYL-C小型組合式搖床 太倉(cāng)市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-1D單人凈化工作臺(tái) 浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；BCD-216SDN冰箱 海爾集團(tuán)；AB123電子天平上海豪晟科學(xué)儀器有限公司；DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器 上海珂淮儀器有限公司；XTL-165-VT數(shù)碼光學(xué)顯微鏡 鳳凰光學(xué)集團(tuán)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落高光譜數(shù)據(jù)的采集及標(biāo)定

1.3.1.1 菌種的培養(yǎng)

將需要滅菌處理的相關(guān)材料進(jìn)行高壓滅菌處理（121 ℃，20 min），并將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中。然后將經(jīng)過擴(kuò)增培養(yǎng)的各菌液用0.85%生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，選擇2 種合適的稀釋梯度（生長(zhǎng)出的菌落數(shù)量在30～300 CFU之間）進(jìn)行涂布，每個(gè)涂布濃度平行4 次，得到5 種菌總共40 個(gè)平板，5 個(gè)批次培養(yǎng)后得到5 種菌總共200 個(gè)培養(yǎng)皿。此類培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)出的菌落供后期提取菌落光譜信息使用，傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)的培養(yǎng)按照參考文獻(xiàn)[20-22]方法進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。

1.3.1.2 高光譜的采集與標(biāo)定

高光譜攝像頭的分辨率為775×1 628，高光譜的波長(zhǎng)范圍為432～963 nm，最終得到一個(gè)大小為775×1 628×618的高光譜數(shù)據(jù)塊。在進(jìn)行光譜采集時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)由于打光不均勻?qū)е鹿庹諒?qiáng)度在各個(gè)波段的不同以及傳感器中暗電流的存在，所獲取的高光譜圖像在光照強(qiáng)度較弱的波段出現(xiàn)較大的噪聲，而且會(huì)在不同波長(zhǎng)下光譜圖像出現(xiàn)亮度差異較大等情況[24]。因此在圖像采集完成后需要對(duì)光譜圖像進(jìn)行黑白板校正[25]，校正公式如下式所示：

式中：Iλ為樣品原始高光譜圖像中λ波段對(duì)應(yīng)的反射強(qiáng)度；Bλ為高光譜黑板校正圖像中λ波段對(duì)應(yīng)的反射強(qiáng)度；Wλ為高光譜白板校正圖像中λ波段對(duì)應(yīng)的反射強(qiáng)度；Rλ為樣品校正后高光譜圖像中λ波段對(duì)應(yīng)的反射強(qiáng)度。

1.3.2 高光譜信息的提取與數(shù)據(jù)處理

1.3.2.1 高光譜信息的提取

圖像采集并標(biāo)定完后，采用ENVI軟件進(jìn)行特征光譜信息的提取[26]。所選對(duì)象菌落生長(zhǎng)較好、大而厚實(shí)，定義一個(gè)圓形感興趣區(qū)域，提取此感興趣區(qū)域在不同波長(zhǎng)下的光譜信息。采集培養(yǎng)皿中5 個(gè)單獨(dú)菌落的光譜數(shù)據(jù)并取平均值得到一條原始光譜，以此方式得到200 個(gè)培養(yǎng)皿對(duì)應(yīng)的200 條光譜數(shù)據(jù)。

1.3.2.2 高光譜信息的預(yù)處理

菌落的感興趣區(qū)域除包含一些可進(jìn)行樣本表征的有利信息外，通常受環(huán)境、機(jī)器運(yùn)行狀況等影響，會(huì)攜帶一些樣本信息以外的光譜信息，如基線漂移、高頻噪聲、背景信息等，都會(huì)嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此有必要對(duì)所獲的光譜區(qū)域進(jìn)行光譜預(yù)處理，除去光譜中無用光譜信息、降低噪聲干擾、減少基線漂移提高建立模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[27]。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standard normal variate transformation，SNV）、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）4 種方法進(jìn)行光譜預(yù)處理[28]，通過比較4 種方法處理后的效果，選出最優(yōu)方法作為本實(shí)驗(yàn)的預(yù)處理方法。

1.3.2.3 主成分分析（principal component analysis，PCA）

高光譜信息中除了含有大量的噪聲以外，還存在著大量的無關(guān)變量或重疊信息。為降低眾多信息中共存、相互重疊的信息，本研究采用PCA法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。

1.3.3 菌落計(jì)數(shù)模型的建立

本實(shí)驗(yàn)通過建立K-最近鄰法（K-nearest neighbors，KNN）、誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（back propagationartificial neural network，BP-ANN）、最小二乘支持向量機(jī)（least squares support vector machines，LS-SVM）3 種模型，對(duì)比3 種模型識(shí)別率判斷最佳的計(jì)數(shù)模型。由于主成分?jǐn)?shù)對(duì)KNN模型的識(shí)別結(jié)果具有較大影響，本實(shí)驗(yàn)選取前10 個(gè)主成分和10 個(gè)K值對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化。BPANN模型的輸出層單元設(shè)為5 個(gè)（菌落種類），傳遞函數(shù)為雙曲線正切函數(shù)，初始權(quán)重為0.95，學(xué)習(xí)因子和動(dòng)量因子均為0.1，收斂誤差設(shè)置為0.000 2，訓(xùn)練迭代次數(shù)為1 500 次。采用交叉驗(yàn)證和網(wǎng)格搜索法對(duì)LS-SVM模型的最佳參數(shù)進(jìn)行選擇，以校正集交叉驗(yàn)證均方根誤差最小為指標(biāo)確定最優(yōu)的徑向基核正規(guī)劃參數(shù)γ和基于徑向基核函數(shù)的參數(shù)σ2，經(jīng)過優(yōu)化得到，最佳主成分為4時(shí)，最佳參數(shù)γ為2.358 5，σ2為1.302 1。將經(jīng)過預(yù)處理后的200 條光譜數(shù)據(jù)集按照K-S（Kennard-Stone）法分成125 個(gè)校正集和75 個(gè)預(yù)測(cè)集分別建立KNN模型、BP-ANN模型和LS-SVM模型，校正集數(shù)據(jù)用來建立模型，預(yù)測(cè)集用來檢測(cè)模型的準(zhǔn)確性，通過比較3 種模型的識(shí)別率和最佳主成分?jǐn)?shù)優(yōu)選出最佳計(jì)數(shù)模型。模型的識(shí)別結(jié)果將5 種菌落分別分為1、2、3、4、5 類，每條光譜對(duì)應(yīng)著一個(gè)模式識(shí)別編號(hào)。編號(hào)1為保加利亞乳桿菌，編號(hào)2為干酪乳桿菌，編號(hào)3為嗜熱鏈球菌，編號(hào)4為嗜酸乳桿菌，編號(hào)5為植物乳桿菌。統(tǒng)計(jì)編號(hào)1、2、3、4、5的數(shù)量，即對(duì)應(yīng)著不同菌落的數(shù)量，具體流程詳見圖1。

1.3.4 益生菌酸奶中各種菌落數(shù)量及總數(shù)的確定

1.3.4.1 益生菌酸奶的制備

益生菌酸奶的制備參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行。

圖1 高光譜菌落計(jì)數(shù)流程Fig. 1 Flow chart showing the process of colony counting using hyperspectral imaging

1.3.4.2 基于高光譜技術(shù)的模式識(shí)別法同時(shí)計(jì)數(shù)各種菌落及總數(shù)

取出部分自制酸奶樣品，用0.85%生理鹽水稀釋至10－8，經(jīng)過大量預(yù)實(shí)驗(yàn)表明10－6、10－7兩個(gè)濃度梯度生長(zhǎng)的菌落數(shù)量在30～300 CFU之間，因此選擇10－6、10－7兩個(gè)濃度梯度作為涂布濃度。吸取該稀釋濃度的菌液0.1 mL均勻涂布在MRS培養(yǎng)基上，置于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后取出。提取混合菌落中每一株菌落的光譜信息，按照1.3.1、1.3.2節(jié)方法進(jìn)行光譜的提取和預(yù)處理操作，最后將處理后的光譜數(shù)據(jù)集代入1.3.3節(jié)中已建立好的光譜模型中，根據(jù)菌落的識(shí)別結(jié)果統(tǒng)計(jì)每一種菌的數(shù)量。識(shí)別結(jié)果中5 種編號(hào)的總和為酸奶中菌落總和，編號(hào)2、4、5的和為自制酸奶中益生菌的總和。

1.3.4.3 傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)

采用上述相同的濃度梯度進(jìn)行不同菌落的傳統(tǒng)方法計(jì)數(shù)。嗜熱鏈球菌的計(jì)數(shù)按照GB 4789.35—2016中規(guī)定的MC培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，將稀釋后的菌液加入到無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入15 mL MC培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)（72±3）h，將菌落中等偏小、邊緣整齊平滑的紅色菌落計(jì)數(shù)為嗜熱鏈球菌；干酪乳桿菌的計(jì)數(shù)按照文獻(xiàn)[20]規(guī)定的選擇性培養(yǎng)基-LC培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，具體為取稀釋菌液于LC培養(yǎng)基中涂布，然后在（25±1）℃培養(yǎng)（72±3）h，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出來的菌落記為干酪乳桿菌數(shù)量；嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的數(shù)量按照文獻(xiàn)[21]所描述的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，采用山梨醇-MRS培養(yǎng)基計(jì)數(shù)植物乳桿菌的數(shù)量，麥芽糖-MRS培養(yǎng)基計(jì)數(shù)植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌的數(shù)量，然后兩者的差值即為嗜酸乳桿菌的數(shù)量；按照文獻(xiàn)[22]中的酸化MRS培養(yǎng)基在厭氧的培養(yǎng)環(huán)境下計(jì)數(shù)保加利亞乳桿菌的數(shù)量。

實(shí)驗(yàn)過程中2 種方法在涂布時(shí)保證為同一批稀釋度樣品，且涂布量相同，每份樣品平行10 次，記錄各菌落的數(shù)量，將2種方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜預(yù)處理及PCA結(jié)果

2.1.1 光譜預(yù)處理結(jié)果

圖2 不同預(yù)處理方法后的菌落樣本的光譜曲線Fig. 2 Hyperspectral curves of colony samples with different pretreatments

采用SNV、MSC、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)4 種不同的預(yù)處理方法對(duì)618 個(gè)波長(zhǎng)下的全光譜數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理后的各菌落光譜曲線如圖2所示。根據(jù)4 種預(yù)處理得到的光譜曲線去噪效果來看，SNV預(yù)處理后的光譜曲線明顯較其他幾種預(yù)處理的光譜曲線平滑，其原因可能在于SNV預(yù)處理在消除樣本顆粒大小、散射或光程引起的樣本間光譜誤差效果較好。雖然MSC在處理校正散射方面較強(qiáng)，但在其他噪聲方面不足，求導(dǎo)處理后的光譜曲線更注重的是確定吸收峰和肩峰的位置，提高光譜的靈敏度和光譜細(xì)節(jié)，而在降噪方面略顯不足[29-30]。但是合適預(yù)處理方法的判定仍需要綜合模型的識(shí)別率進(jìn)行選擇。

由表1可以看出，SNV預(yù)處理后的光譜模型識(shí)別效果優(yōu)于其他預(yù)處理后的模型，可以有效對(duì)光譜中的噪聲和其他干擾進(jìn)行校正。因此本研究在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均采用SNV預(yù)處理方法。

表1 不同預(yù)處理方法對(duì)模型效果的結(jié)果分析Table 1 Comparison of different spectral preprocessing methods

2.1.2 PCA結(jié)果

圖3 三維主成分空間分布圖Fig. 3 Three-dimensional projection from principal component analysis

由圖3可知，第1主成分代表了77.03%的光譜信息，第2主成分代表了5.15%的光譜信息，第3主成分代表了4.88%的光譜信息，前3 主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85%以上，能夠代表光譜中的大多數(shù)信息。根據(jù)各菌落在三維主成分中的分布來看，幾種菌落均具備明顯的聚類特征，暗示了菌落與菌落之間具備一定的類別特征。其中干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌3 種菌落的區(qū)別特征較為明顯，能很好地與其他菌落進(jìn)行區(qū)分。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌2 種菌落重疊較為嚴(yán)重，其原因可能是這2 種菌落均為發(fā)酵菌種，且兩者之間存在共生作用，具有相似的代謝物，因此需要通過進(jìn)一步建立模型進(jìn)行鑒別區(qū)分。

2.2 最優(yōu)計(jì)數(shù)模型選擇結(jié)果

將200 條光譜數(shù)據(jù)集按照K-S方法隨機(jī)分成125 條校正集光譜和75 條預(yù)測(cè)集光譜，分別建立KNN、BPANN、LS-SVM模型，模型的識(shí)別結(jié)果如表2所示。當(dāng)主成分為9時(shí)，LS-SVM模型的識(shí)別率高于另外2 種模型，模型的綜合識(shí)別率中校正集識(shí)別率為99.20%，預(yù)測(cè)集識(shí)別率為93.33%，為最優(yōu)計(jì)數(shù)模型。KNN模型識(shí)別率相對(duì)于LS-SVM識(shí)別率低的原因可能在于內(nèi)部算法方面不足。KNN模型采用的是“表決”方法，按照同類樣本相互靠近和少數(shù)服從多數(shù)的原則進(jìn)行表決，在解決不同種屬的樣本分類問題上效果較好，而在解決同種屬、不同類問題上效果較差[31]。在需要進(jìn)行分類鑒定的幾種菌落中，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌屬于相同的屬（乳桿菌屬）不同的種，因而區(qū)分率較低。盡管BP-ANN校正集的識(shí)別率達(dá)到了100%，但是在進(jìn)行預(yù)測(cè)集驗(yàn)證的時(shí)候識(shí)別率仍然很低，其原因可能是BP-ANN算法是一種按照誤差逆?zhèn)鞑ニ惴ㄓ?xùn)練的多層前饋網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)輸出不等于期望輸出時(shí)則進(jìn)入反向傳播過程，直到網(wǎng)絡(luò)的全局誤差小于給定的值后學(xué)習(xí)終止，實(shí)際上預(yù)測(cè)能力并沒有達(dá)到相應(yīng)的水平，因此導(dǎo)致較低的識(shí)別率。LS-SVM是在經(jīng)典SVM算法上進(jìn)行改進(jìn)，代替經(jīng)典SVM中復(fù)雜的二次優(yōu)化問題獲得支持向量，降低了計(jì)算的復(fù)雜性，加快求解速度，并且能夠在少量的訓(xùn)練樣本中進(jìn)行高維特征空間學(xué)習(xí)。從最佳主成分?jǐn)?shù)量上來看，KNN模型具有最小的主成分?jǐn)?shù)7，所建模型相對(duì)簡(jiǎn)單，LS-SVM所建模型具有最大的主成分?jǐn)?shù)，相對(duì)KNN和BPANN模型較復(fù)雜，權(quán)衡考慮計(jì)數(shù)模型的準(zhǔn)確性，故本研究選取了識(shí)別率最高的LS-SVM模型作為最佳計(jì)數(shù)模型。

表2 不同模型的識(shí)別結(jié)果比較Table 2 Comparison of recognition results with different models

2.3 高光譜菌落計(jì)數(shù)法與傳統(tǒng)培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法的比較

表3 2 種計(jì)數(shù)方法結(jié)果的比較Table 3 Comparison of two counting methods

由表3可知，2 種不同的計(jì)數(shù)方法結(jié)果較為接近，其中相同的菌落采用不同的計(jì)數(shù)方法得到的結(jié)果均未達(dá)到顯著性差異（P＞0.05），但高光譜計(jì)數(shù)法未能與傳統(tǒng)方法達(dá)到一致，其原因可能為：1）傳統(tǒng)的微生物計(jì)數(shù)法本身就是一個(gè)大約近似的方法，選擇性培養(yǎng)基并不是完全的具備選擇性；2）在實(shí)驗(yàn)過程中存在著樣品均勻性、偶然性問題；3）高光譜數(shù)據(jù)在進(jìn)行處理的過程中仍然存在較大的噪聲，導(dǎo)致在建立模型時(shí)，由于模型的精度不夠而導(dǎo)致的模型錯(cuò)誤識(shí)別等。但就總體而言，2 種方法在益生菌總數(shù)的計(jì)數(shù)中沒有表現(xiàn)出較大的偏差，可以表明2 種方法在理論計(jì)數(shù)上無明顯差異。因此可以表明，高光譜計(jì)數(shù)法可以對(duì)酸奶中活性益生菌快速、無損、準(zhǔn)確地進(jìn)行計(jì)數(shù)，避免了傳統(tǒng)計(jì)數(shù)法對(duì)酸奶中活性益生菌技術(shù)需要不同培養(yǎng)基的繁瑣過程，滿足了實(shí)際生產(chǎn)和檢測(cè)工作中的需要。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)混合發(fā)酵酸奶中的發(fā)酵菌種（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）和益生菌種（干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌）的鑒別與計(jì)數(shù)。首先采集經(jīng)過48 h培養(yǎng)的5 種菌種的高光譜信息，將得到的光譜信息分別采用不同的預(yù)處理方式（SNV、MSC、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)）進(jìn)行預(yù)處理降噪，采用PCA法對(duì)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)集進(jìn)行降維，采用不同的模式識(shí)別方法建立5 種菌落的快速計(jì)數(shù)模型，根據(jù)幾種模型的識(shí)別率確定最佳的計(jì)數(shù)模型。最后培養(yǎng)自制酸奶樣品，對(duì)比高光譜菌落計(jì)數(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，判斷高光譜菌落計(jì)數(shù)的可行性。結(jié)果表明，采用SNV預(yù)處理后的光譜在提高模型精度效果上最佳。當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為9時(shí)，LS-SVM模型所對(duì)應(yīng)的校正集識(shí)別率為99.20%，預(yù)測(cè)集識(shí)別率為93.33%，模型的識(shí)別率和穩(wěn)定性為最佳計(jì)數(shù)模型。對(duì)比最佳模型菌落計(jì)數(shù)和傳統(tǒng)計(jì)數(shù)法對(duì)自制酸奶中各種益生菌的計(jì)數(shù)結(jié)果，二者并無顯著性差異（P＞0.05），驗(yàn)證了高光譜技術(shù)對(duì)混合發(fā)酵酸奶中多種菌種同時(shí)存在情況下對(duì)每種益生菌同時(shí)計(jì)數(shù)方法的可行性。