高文宏，葉瑞森，潘廷跳，曾新安

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

冷凍魚糜是生產(chǎn)各類魚糜制品（魚香腸、魚丸、模擬蟹肉等）的原材料，是肌原纖維蛋白的濃縮物[1]。在冷凍過程中，受冰晶的機(jī)械破壞、結(jié)合水的脫離、細(xì)胞液的濃縮、次級(jí)鍵的新生和斷裂等因素的影響，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集和氨基酸多肽鏈逐漸展開，從而導(dǎo)致冷凍變性，蛋白質(zhì)逐漸喪失生物活性[2-4]。隨著冷藏的不斷進(jìn)行，魚糜蛋白物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化[5]：蛋白鹽溶性、總巰基含量、Ca2+-ATP酶活性等呈現(xiàn)下降趨勢；而二硫鍵含量、羰基含量、表面疏水性等則呈現(xiàn)上升趨勢。現(xiàn)階段對(duì)于魚糜蛋白冷凍變性的研究，主要集中在物理化學(xué)性質(zhì)變化方面，較少涉及到微觀分子結(jié)構(gòu)水平，對(duì)變性的解釋多數(shù)停留在假設(shè)階段。為進(jìn)一步探索蛋白質(zhì)冷凍變性規(guī)律，有必要明確凍藏過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。

目前對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究主要采用圓二色譜、熒光光譜、核磁共振、紅外吸收光譜和拉曼光譜等技術(shù)。其中，拉曼光譜是一種包含分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)及結(jié)構(gòu)等信息的散射光譜，受水相干擾小，可以對(duì)固、液相樣品進(jìn)行快速無損檢測[6-7]。該技術(shù)通過反射氨基酸或者肽鏈的不同種振動(dòng)模式得到響應(yīng)信號(hào)，能提供包含蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)信息的光譜信息圖[8-9]。作為一種新興的研究手段，拉曼光譜技術(shù)已經(jīng)被運(yùn)用到監(jiān)控肉類蛋白（如肌球蛋白）結(jié)構(gòu)變化[10-11]。本實(shí)驗(yàn)基于拉曼光譜檢測技術(shù)，對(duì)草魚魚糜進(jìn)行光譜掃描并獲得拉曼“指紋譜”，重點(diǎn)討論魚糜蛋白特征峰區(qū)帶圖譜，解析魚糜蛋白結(jié)構(gòu)變化信息，嘗試在分子層面評(píng)價(jià)魚糜蛋白冷凍變性；同時(shí)利用化學(xué)方法輔助驗(yàn)證蛋白冷凍變性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活草魚 市購；超微量Ca2+-ATP酶測試盒 南京建成生物工程研究所；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

YLS-86A食品加工機(jī) 中山市雅樂思電器實(shí)業(yè)有限公司；JW-3024HR高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津制作所；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；HR Evolution拉曼光譜儀 美國HORIBA Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜樣品的制備

新鮮草魚去頭尾、鱗片以及內(nèi)臟，用清水沖洗干凈，選取白肉放入食品加工機(jī)中絞碎，得到碎肉分別進(jìn)行清水和（0.15%）鹽水漂洗（溫度10 ℃以下，每次攪拌5 min，靜置3 min）后用紗布進(jìn)行脫水（水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在80%），得到新鮮魚糜定型于圓柱形鋁制模具（半徑2 cm，高1.5 cm），封口袋包裝后置于－18 ℃凍藏。整個(gè)加工過程用碎冰控制溫度。分別對(duì)新鮮魚糜樣品、凍藏2 周和凍藏8 周魚糜樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.3.2 鹽溶性蛋白含量的測定

參照楊利艷等[12]的方法，略作修改。2 g魚糜添加20 mL磷酸緩沖液（I=0.05，pH 7.5），充分勻漿30 s，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，棄去上清液。重復(fù)上述步驟1 次。所得沉淀添加20 mL Weber-Edsall溶液（0.6 mol/L KCl-0.01 mol/L NaCO3-0.04 mol/L NaHCO3），充分勻漿30 s，置于4 ℃提取20 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，上清液用雙縮脲法測定鹽溶性蛋白含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白液的提取

參照胡耀輝等[13]的方法，略作修改。2 g魚糜添加20 mmol/L Tris-maleate溶液（pH 7.0，內(nèi)含0.05 mol/L KCl），充分勻漿30 s，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，棄去上清液。所得沉淀添加20 mmol/L Tris-maleate溶液（pH 7.0，內(nèi)含0.5 mol/L KCl），充分勻漿30 s，置于4 ℃提取1 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，上清液為肌原纖維蛋白液。

1.3.4 巰基含量的測定

參照張靜雅等[14]的方法，略作修改。肌原纖維蛋白液稀釋至4 mg/mL，取0.5 mL稀釋蛋白液加入4.5 mL 0.2 mol Tris-HCl緩沖液（內(nèi)含8 mol脲素、2%十二烷基硫酸鈉、10 mmol/L EDTA，pH 6.8），混勻后取出4 mL混合液加入0.4 mL 0.1%的5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），40 ℃水浴25 min，于波長412 nm處測定吸光度?？瞻捉M用0.6 mol/L KCl溶液代替。按下式計(jì)算巰基含量，以105g蛋白中含有巰基的物質(zhì)的量計(jì)：

式中：A為波長412 nm處的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；ε為分子吸光系數(shù)13 600L/（mol·cm）；c為蛋白液質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 Ca2+-ATP酶活力測定

采用南京建成生物工程研究所超微量Ca2+-ATP酶測試盒測定，以每小時(shí)每毫克蛋白質(zhì)產(chǎn)生無機(jī)磷的量（μmol/（mg·h））表示。

1.3.6 拉曼光譜掃描

將少量魚糜樣品平鋪在玻璃片上，置于載物臺(tái)上進(jìn)行拉曼光譜掃描。采用氬離子激光器作為拉曼掃描光源，激光波長為633 nm，拉曼位移波數(shù)范圍為350～3 500 cm－1，采集時(shí)間為10 s，累積2 次。每個(gè)樣品取3 個(gè)點(diǎn)掃描，最終拉曼光譜曲線取3 次結(jié)果的平均值。采用拉曼設(shè)備配套軟件LabSpec 6對(duì)光譜進(jìn)行基點(diǎn)校正并扣除熒光背底，以（1 004±2）cm－1（苯丙氨酸殘基在該峰位處保持穩(wěn)定振動(dòng)[15]）處峰位為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行歸一化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)定量通過Peakfit 4.12軟件進(jìn)行峰的分離和曲線擬合，數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚魚糜鹽溶性蛋白、巰基和Ca2＋-ATP酶活力的變化

圖1 草魚魚糜鹽溶性蛋白、巰基和Ca2＋-ATP酶活力變化Fig. 1 Changes in salt-soluble protein, sulfhydryl content and Ca2+-ATPase activity of grass carp surimi

在凍結(jié)和凍藏過程中，肌動(dòng)球蛋白受大冰晶破壞以及蛋白水化層的消解等作用而發(fā)生冷凍變性，主要表現(xiàn)在蛋白桿部性質(zhì)變化、鹽溶解性下降[16-17]。而肌動(dòng)球蛋白是肌原纖維蛋白的重要組成部分，所以蛋白鹽溶性是反應(yīng)魚糜蛋白冷凍變性的常用指標(biāo)。同時(shí)隨著蛋白冷凍變性的不斷深入，蛋白分子之間生成疏水鍵和氫鍵等非共價(jià)鍵，生成超大的不溶性聚合體，鹽溶性蛋白含量減少[4]。由圖1可知，新鮮、凍藏2 周以及凍藏8 周的魚糜鹽溶性蛋白含量分別為103.61、66.83 mg/g和57.66 mg/g，凍藏2 周和凍藏8周分別下降了35.50%和44.35%?？梢?，凍藏前2 周造成鹽溶性蛋白含量大幅下降（36.78 mg/g），后2～8 周又持續(xù)小幅下降了9.17 mg/g。

巰基含量的減少也是魚糜蛋白冷凍變性的重要體現(xiàn)。隨著凍藏時(shí)間的延長，巰基含量從新鮮魚糜的5.79 mol/105g下降到第2周的3.30 mol/105g，至凍藏8 周結(jié)束，巰基含量為1.74 mol/105g，下降幅度達(dá)69.95%。蛋白分子的聚集和變性引起巰基的暴露，使得巰基逐漸被氧化成二硫鍵，從而進(jìn)一步改變蛋白分子的空間構(gòu)型，加劇蛋白的冷凍變性。同時(shí)，在肌球蛋白活躍區(qū)域的巰基與Ca2＋-ATP酶活力密切相關(guān)[18]。

Ca2＋-ATP酶活力是反映肌球蛋白完整的主要探針，在一定程度上反映了蛋白的冷凍變性，其活性越高，說明蛋白品質(zhì)越高[19-20]。Ca2＋-ATP酶活力在凍藏過程中不斷下降，新鮮、凍藏2 周以及凍藏8 周分別為0.60、0.44、0.13 μmol/（mg·h），凍藏2 周和凍藏8 周的下降幅度分別達(dá)到26.67%和78.33%。

2.2 草魚魚糜蛋白拉曼光譜圖

圖2 草魚魚糜蛋白拉曼圖譜Fig. 2 Raman spectra of grass carp surimi proteins

如圖2所示，魚糜蛋白空間構(gòu)象與氨基酸殘基微環(huán)境的變化主要集中在500～1 800 cm－1（指紋圖譜區(qū)）和2 800～3 050 cm－1（C—H伸縮振動(dòng)區(qū)）體現(xiàn)。通過對(duì)比魚糜樣品在上述2 個(gè)重要拉曼譜帶的特征峰峰位和相對(duì)峰強(qiáng)度信息，可以解釋凍藏對(duì)草魚魚糜蛋白結(jié)構(gòu)變化的具體影響。魚糜蛋白拉曼光譜區(qū)帶的指認(rèn)[10-11,15,21]，如表1所示。

表1 草魚魚糜蛋白拉曼光譜中譜帶歸屬Table 1 Tentative assignment of selected bands in the Raman spectra of grass carp surimi proteins

2.3 蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象

圖3 草魚魚糜蛋白酰胺III區(qū)拉曼圖譜Fig. 3 Raman spectra in amide III region of grass carp surimi proteins

拉曼特征光譜中酰胺III區(qū)（1 230～1 350 cm－1）是構(gòu)象靈敏的譜帶區(qū)。該譜帶區(qū)域能提供多肽鏈主鏈構(gòu)象的振動(dòng)信息[21]，包括C—N伸縮振動(dòng)、N—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)、Cα—C伸縮振動(dòng)以及C＝O面內(nèi)彎曲振動(dòng)。另外，圖譜中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)、多種形式的C—H彎曲振動(dòng)以及芳香環(huán)的振動(dòng)信息也反映了碳骨架的主鏈構(gòu)象。

如圖3所示，新鮮、凍藏2 周以及凍藏8 周的魚糜蛋白拉曼峰分別出現(xiàn)在1 320、1 320、1 315 cm－1處，相對(duì)峰強(qiáng)為0.949 7、0.960 7、0.902 4。凍藏前2 周，該處拉曼峰峰位置未出現(xiàn)變化。而隨著凍藏時(shí)間繼續(xù)延長，魚糜蛋白在酰胺III區(qū)的拉曼峰逐漸向小波數(shù)方向偏移。至8 周凍藏期結(jié)束，拉曼峰位偏移了5 cm－1，整體峰強(qiáng)的減小，說明魚糜蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少。但凍藏2 周魚糜樣品的拉曼峰峰強(qiáng)有所上升，尚未得到很好的解釋。魚糜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊譜帶（1 230～1 245 cm－1）和無規(guī)卷曲譜帶（1 240～1 255 cm－1）部分重疊，使得酰胺III區(qū)的解析相對(duì)困難。凍藏2 周以及凍藏8 周相比新鮮魚糜蛋白，在1 250 cm－1附近中均形成了拐角，峰形坡度有所減緩，并且凍藏8 周的減緩趨勢更加明顯。有研究表明[11]，在1 250 cm－1和1 315 cm－1附近形成的譜帶分別是由肌球蛋白的球形結(jié)構(gòu)和纖維狀結(jié)構(gòu)的頭部和尾部區(qū)域的α-螺旋結(jié)構(gòu)引起的。蛋白質(zhì)分子的冷凍變性、巰基的氧化、水分子-蛋白質(zhì)分子間氫鍵的變化，造成了蛋白質(zhì)原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的破壞。

碳鏈骨架中C—C伸縮振動(dòng)能引起940 cm－1（圖3）附近拉曼峰的變化，是α-螺旋結(jié)構(gòu)在拉曼光譜上的另一個(gè)重要體現(xiàn)。該峰的相對(duì)強(qiáng)度從新鮮狀態(tài)的0.931 8下降到凍藏8 周后的0.891 3，相對(duì)強(qiáng)度下降幅度達(dá)到了4.37%。蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的破壞并逐步向β-折疊和無規(guī)卷曲的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致了該區(qū)段譜帶信號(hào)減弱。

2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)定量結(jié)果

酰胺I區(qū)（1 600～1 700 cm－1）對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的解析提供了更加豐富的信息。這個(gè)譜帶區(qū)域不僅含有C＝O伸縮振動(dòng)的信息，還提供了多肽鏈基團(tuán)內(nèi)部的C—N伸縮振動(dòng)、Cα—C—N彎曲振動(dòng)以及N—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)的信息[22]。魚糜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其的加工特性影響顯著[23]：α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量與加工中的凝膠強(qiáng)度密切相關(guān)；β-折疊結(jié)構(gòu)則提供了魚糜凝膠的硬度；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)則不能促使生成有序的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。一些拉曼光譜和紅外光譜的蛋白質(zhì)解析工作發(fā)現(xiàn)[24-25]，酰胺I區(qū)的譜帶信息與蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象和二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量相關(guān)。多肽鏈分子的天然構(gòu)象決定了肽鏈-肽鏈分子間的氫鍵易改變，造成了酰胺I區(qū)的圖譜信息的改變。

蛋白質(zhì)中二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的不同，會(huì)影響其在酰胺I區(qū)的峰形[9,26-27]：α-螺旋結(jié)構(gòu)含量高的蛋白在該譜段的峰會(huì)集中在1 645～1 657 cm－1之間，β-折疊結(jié)構(gòu)含量高的會(huì)集中在1 665～1 680 cm－1之間，而1 660 cm－1之間附近的拉曼峰則預(yù)示蛋白質(zhì)無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量高。代表蛋白不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的拉曼峰存在一定程度的峰位重疊的現(xiàn)象，造成了各二級(jí)結(jié)構(gòu)定量上的困難。實(shí)驗(yàn)中通過去卷積、求二階導(dǎo)和曲線擬合的方法對(duì)拉曼峰進(jìn)行分峰處理，得到單個(gè)峰位信息。

圖4 草魚魚糜蛋白酰胺I區(qū)分峰和迭代擬合曲線Fig. 4 Segregated and iterative curve-fitted Raman bands in amide I region of grass carp surimi proteins

圖5 草魚魚糜蛋白酰胺I區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Fig. 5 Secondary structure contents from amide I band region of grass carp surimi proteins

通過Peakfit 4.12軟件對(duì)酰胺I區(qū)進(jìn)行峰分離和曲線迭代擬合處理得到圖4，然后對(duì)比不同二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的峰的峰面積[27-28]，計(jì)算出草魚魚糜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，如圖5所示。新鮮的魚糜與凍藏2 周和8 周的魚糜相比，α-螺旋含量逐步下降，由新鮮時(shí)相對(duì)含量34.31%下降到凍藏第2周的22.18%，至凍藏第8周時(shí)，α-螺旋相對(duì)含量下降到15.33%?？梢钥闯?，α-螺旋在凍藏初期（2 周內(nèi)）劇烈下降，降幅達(dá)到12.13%，接下來6 周凍藏降幅為6.85%，下降速率減慢。新鮮、凍藏2 周以及凍藏8 周β-折疊相對(duì)含量分別為22.68%、24.33%和21.57%。凍藏過程中，β-折疊相對(duì)含量先略微升高后又下降，這可能是由于凍藏初期蛋白分子內(nèi)或分子間的氫鍵作用力增強(qiáng)，引起β-折疊相對(duì)含量升高，而凍藏后期蛋白持續(xù)變性又引起氫鍵的變化。無規(guī)卷曲的相對(duì)含量持續(xù)增加，由新鮮魚糜的13.47%上升到凍藏8 周的30.89%，而β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量的變化不明顯。

2.5 酪氨酸和色氨酸殘基微環(huán)境

2.5.1 酪氨酸殘基

圖6 草魚魚糜蛋白氨基酸殘基微環(huán)境拉曼圖譜Fig. 6 Raman spectra of amino residue microenvironments from grass carp surimi proteins

酪氨酸殘基上對(duì)位取代苯環(huán)的振動(dòng)能在830 cm－1和850 cm－1附近形成費(fèi)米共振雙峰，此雙峰與基團(tuán)所處的微環(huán)境和酚羥基間的氫鍵作用力有關(guān)[29]，I850/I830反映酪氨酸殘基處于“包埋”或者“暴露”狀態(tài)，是監(jiān)控酪氨酸殘基微環(huán)境的有效探針。當(dāng)I850/I830值介于0.7～1.0時(shí)，酪氨酸殘基處于“包埋”狀態(tài)，表明酪氨酸疏水性基團(tuán)相互聚集，形成疏水核并被埋藏在多肽鏈內(nèi)部；當(dāng)I850/I830值低于0.3，表明酪氨酸殘基中存在強(qiáng)的氫鍵作用力；當(dāng)I850/I830值大于1.0時(shí)，表明酪氨酸殘基暴露在水相或者極性的微環(huán)境中。新鮮、凍藏2 周和凍藏8 周魚糜樣品的I850/I830值分別為1.81、1.89和1.99，如圖6所示，草魚制成魚糜樣品后酪氨酸已經(jīng)處于極性的水相微環(huán)境。這可能與加工過程中漂洗步驟有關(guān)，低溫清水和鹽水的漂洗使魚糜蛋白處于極性的水相環(huán)境中，疏水核受水相環(huán)境的影響逐漸打開，由“包埋”向“暴露”狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。隨著凍藏的深入，冷凍造成的蛋白結(jié)構(gòu)的改變使酪氨酸更加暴露在多肽鏈表面，魚糜樣品的I850/I830值上升。

2.5.2 色氨酸殘基

拉曼光譜中757 cm－1和1 340 cm－1附近區(qū)域能表征色氨酸殘基的微環(huán)境，I757下降（圖6）以及I1340下降（圖3）都反映了色氨酸殘基的暴露[21,30]。凍藏能引起I1340強(qiáng)度的下降，新鮮、凍藏2 周和凍藏8 周該值分別為0.869 0、0.872 1和0.758 9，說明8 周凍藏使色氨酸殘基從包埋的疏水性環(huán)境中暴露到極性環(huán)境。I757先由新鮮的0.275 1降至第2周的0.231 1，也印證了色氨酸殘基的暴露，但是該值在凍藏8 周沒有持續(xù)下降，反而升至0.261 7。這可能是757 cm－1附近色氨酸殘基微環(huán)境譜帶與755 cm－1附近的脂肪族氨基酸殘基振動(dòng)譜帶相互重疊造成的。

2.6 二硫鍵的變化

圖7 草魚魚糜蛋白二硫鍵伸縮振動(dòng)拉曼圖譜Fig. 7 Raman spectra of the stretching vibrations of disulfide bonds from grass carp surimi proteins

二硫鍵的特征振動(dòng)譜帶在500～550 cm－1附近，并且與分子內(nèi)部和分子間的巰基/二硫鍵相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。此譜帶的巰基/二硫鍵高密度區(qū)域能形成多種形式的非網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)。在525 cm－1和545 cm－1附近的振動(dòng)分別為二硫鍵扭式-扭式-反式和反式-扭式-反式構(gòu)象形式[9,26]。由圖7可以看出，新鮮魚糜蛋白的在548 cm－1處出現(xiàn)拉曼峰，這表明未經(jīng)凍藏的魚糜蛋白二硫鍵主要為反式-扭式-反式構(gòu)象。凍藏2 周后二硫鍵的拉曼峰向小波數(shù)（扭式-扭式-反式構(gòu)象譜帶）移動(dòng)至539 cm－1處，至凍藏8 周結(jié)束，拉曼峰移動(dòng)至538 cm－1處。峰位的變化可能是由于部分二硫鍵的構(gòu)象在凍藏初期（2 周內(nèi)）由反式-扭式-反式向扭式-扭式-反式的轉(zhuǎn)變，凍藏2～8 周基本維持不變。隨著凍藏的深入，二硫鍵構(gòu)象持續(xù)變化不大。

2.7 芳香族氨基酸C—H伸縮振動(dòng)

芳香族氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的C—H伸縮振動(dòng)會(huì)在2 900 cm－1附近形成強(qiáng)烈的譜帶。拉曼圖譜中2 933 cm－1處形成尖峰，這是由CH3的對(duì)稱伸縮振動(dòng)或者CH2非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的，而在2 874 cm－1附近形成的次峰則是由CH2非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的[21]。C—H伸縮振動(dòng)形成的拉曼峰峰強(qiáng)的變化可能與羥基鏈在極性環(huán)境中暴露有關(guān)。另有研究[22]猜測α-螺旋結(jié)構(gòu)的展開使得芳香族氨基酸暴露，造成脂肪族氨基酸的C—H基團(tuán)間的疏水作用力增強(qiáng)。同時(shí)，C—H伸縮振動(dòng)拉曼峰的長寬比與蛋白質(zhì)的疏水性和功能特性（如乳化性）有關(guān)[31]。

圖8 草魚魚糜蛋白芳香氨基酸C—H伸縮振動(dòng)拉曼圖譜Fig. 8 Raman spectra of C—H stretching vibrations of aromatic amino acid from grass carp surimi proteins

如圖8所示，經(jīng)過8 周的凍藏，I2874和I2933從新鮮的1.908 1和3.868 7分別下降到1.721 5和3.352 6，降幅達(dá)到9.78%和13.34%。在魚糜凍藏期間，由于肌原纖維蛋白的冷凍變性，造成蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象的變化以及多肽鏈展開，促使芳香族氨基酸側(cè)鏈不斷暴露，形成疏水相互作用力，進(jìn)而又導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)不斷變化，蛋白質(zhì)逐步喪失其功能特性。

3 結(jié) 論

草魚魚糜拉曼光譜中酰胺III區(qū)和940 cm－1峰形和峰強(qiáng)有效提供魚糜蛋白主鏈構(gòu)象信息，凍藏過程中魚糜蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，蛋白構(gòu)象由有序向無序逐漸轉(zhuǎn)變；且酰胺I區(qū)分峰、曲線擬合計(jì)算進(jìn)一步說明這種無序化與無規(guī)卷曲的相對(duì)含量增加有關(guān)。I757、I1340和I850/I830變化，色氨酸和酪氨酸殘基暴露程度逐漸加深。表征二硫鍵構(gòu)象的拉曼峰向小波數(shù)方向移動(dòng)，凍藏可能造成部分二硫鍵由反式-扭式-反式構(gòu)象向扭式-扭式-反式構(gòu)象轉(zhuǎn)變；C—H伸縮振動(dòng)峰I2933的減弱，芳香族氨基酸疏水相互作用力增強(qiáng)。另一方面，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同凍藏期草魚魚糜化學(xué)指標(biāo)的檢測，驗(yàn)證凍藏引起魚糜蛋白的冷凍變性。綜上，拉曼光譜技術(shù)能夠有效評(píng)價(jià)冷藏對(duì)魚糜蛋白結(jié)構(gòu)的影響，是利用化學(xué)特性評(píng)價(jià)冷凍魚糜蛋白體系的另一重要補(bǔ)充，從蛋白結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵變化等方面更加微觀具體地評(píng)價(jià)冷凍變性。