段長(zhǎng)平，劉連利，魏旭青，徐姝穎，李秋瑩，孫 彤,*，勵(lì)建榮,*

（1.生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；3.中核四〇四有限公司，甘肅 蘭州 730000；4.渤海大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理中心，遼寧 錦州 121013）

越來(lái)越多的研究顯示，人類(lèi)生活中的細(xì)菌感染大部分是由生物被膜引起的，單純由游離菌導(dǎo)致的食物中毒并不多見(jiàn)[1-2]。因此在食品生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中形成的生物被膜可能是引起食源性疾病的根本原因[3-5]。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）為革蘭氏陰性菌，是一種典型水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌，它大量存在于水、土壤及高水分高蛋白食品中，可還原氧化三甲胺，并產(chǎn)生H2S。腐敗希瓦氏菌易黏附于材料表面，從而形成生物被膜[6-7]。由于生物被膜的黏附性遠(yuǎn)高于游離菌，若食品加工環(huán)境受到生物被膜污染，將很難處理干凈且易留下污染源，進(jìn)而腐蝕食品生產(chǎn)設(shè)備和包裝材料，使生產(chǎn)成本提高，威脅食品安全[3,8]。抑制生物被膜的方法很多，但在生產(chǎn)過(guò)程中加藥對(duì)食品安全的威脅顯而易見(jiàn)[9-11]。因此，研制有效抑制生物被膜形成及生長(zhǎng)的材料將為解決食品生產(chǎn)中的微生物污染提供技術(shù)支持[12]。

微納米級(jí)ZnO作為廣泛使用的一種無(wú)機(jī)抗菌劑，具有良好的穩(wěn)定性和安全性[13-15]。制備ZnO的方法主要有直接沉淀法[16-17]、水熱合成法[18-19]、溶膠-凝膠（sol-gel）法[20-21]、化學(xué)蒸汽沉積法[22]等。Asakuma等[21]采用提拉法將溶膠均勻涂于基片上，高溫退火處理后得到納米ZnO薄膜。sol-gel法制備的納米薄膜具有形貌均勻、可控、反應(yīng)條件溫和、重復(fù)性好等特點(diǎn)。有研究表明，借助ZnO的抗菌性能，ZnO納米粒子具有顯著的抑制生物被膜性能[23-24]，故有望應(yīng)用ZnO薄膜作為抑制生物被膜的形成和生長(zhǎng)的材料。

降低水產(chǎn)品加工及貯藏過(guò)程中容器及設(shè)備表面生物被膜殘留能夠減少其對(duì)產(chǎn)品的影響及設(shè)備的破壞，本實(shí)驗(yàn)采用sol-gel法于多孔鈦片表面制備納米ZnO薄膜，借助X射線衍射光譜（X-ray diffraction，XRD）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、選區(qū)電子衍射（selected area electron diffraction，SAED）等表征手段研究涂膜次數(shù)對(duì)ZnO薄膜微觀結(jié)構(gòu)的影響。以水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌為作用對(duì)象，考察ZnO薄膜微觀結(jié)構(gòu)對(duì)其生物被膜抑制性能的影響。研究結(jié)果可為制備對(duì)水產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌生物被膜具有抑制作用的薄膜材料提供技術(shù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：腐敗希瓦氏菌（S. putrefaciens，ATCC8071，美國(guó)微生物菌種保藏中心，實(shí)驗(yàn)室保藏）；培養(yǎng)基：LB肉湯、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂；試劑：結(jié)晶紫、無(wú)水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、戊二醛等均為分析純；高純鈦箔（99.99%，0.02 mm） 清河縣佳潤(rùn)金屬材料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultima IV型X射線粉末衍射儀 日本理學(xué)Rigaku公司；2000FT-IR型紅外分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；S-4800型場(chǎng)發(fā)射SEM 日本日立公司；Jem-2100F型場(chǎng)發(fā)射TEM 日本電子株式會(huì)社；OCA15EC型接觸角測(cè)量?jī)x北京東方德菲儀器有限公司；Victor X3酶標(biāo)儀 上海珀金埃爾默儀器有限公司；WU800角磨機(jī) 寶時(shí)得機(jī)械（中國(guó)）有限公司；SK8210HP超聲波清洗器、上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；DF-II集熱式磁力加熱攪拌器 江蘇省榮華儀器制造有限公司；MS605D直流穩(wěn)壓電源 東莞市邁豪電子科技有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；LRH型系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PL602-L電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多孔鈦片及ZnO薄膜的制備

1.3.1.1 陽(yáng)極氧化法制備多孔鈦片

角磨機(jī)打磨鈦片至表面光滑，分別于丙酮、乙醇中超聲清洗10 min（40 Hz、200 W），烘干。在拋光液（V（HF）∶V（HNO3）=1∶3）中化學(xué)拋光60 s后于去離子水中超聲清洗10 min，烘干。以鈦片為陽(yáng)極，石墨為陰極，電極間距4.0 cm，電壓14.0 V，0.4% HF電解液中陽(yáng)極氧化60 min。去離子水、乙醇清洗，干燥，得孔徑約為50 nm的多孔鈦片，待用。

1.3.1.2 sol-gel法制備ZnO薄膜

室溫劇烈攪拌下，將50 mL 0.15 mol/L的NaOH-乙醇溶液迅速加入至50 mL 0.075 mol/L的乙酸鋅-乙醇溶液中，得混合溶液。多孔鈦片浸于沸騰的無(wú)水乙醇中1 h取出，于－0.08 MPa抽真空30 min后將其浸于上述混合溶液中，浸漬20 min后加熱至80 ℃，40 min后得藍(lán)色溶膠，取出多孔鈦片，水洗。100 ℃干燥2 h，得sol-gel涂膜1 次樣品。同條件下多孔鈦片sol-gel涂膜4 次后干燥，得另一樣品。收集同時(shí)制備的粉體，待用。

1.3.2 材料表征分析

采用X射線粉末衍射儀對(duì)同期制備粉體進(jìn)行晶型分析，CuKα輻射，40 kV，50 mA，步寬0.02°，掃描速率4 °/min。利用KBr壓片法，采用2000FT-IR型紅外分光光度計(jì)測(cè)定ZnO薄膜剝離粉體的FTIR光譜，測(cè)試范圍4 000～400 cm－1，分辨率0.5 cm－1。采用S-4800型場(chǎng)發(fā)射SEM觀察樣品微觀形貌。采用Jem-2100F型場(chǎng)發(fā)射TEM測(cè)定剝離的多孔鈦片和ZnO薄膜的微觀形貌，并對(duì)其進(jìn)行SAED分析。運(yùn)用切線法，采用OCA15EC型接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定樣品的水接觸角。

1.3.3 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜附著性能測(cè)定

取活化后OD595nm約為0.5的腐敗希瓦氏菌的菌懸液，以1∶200稀釋，取1 mL稀釋后菌液于無(wú)菌離心試管中，放入基片（0.5 cm×0.5 cm），28 ℃培養(yǎng)一定時(shí)間后取出。

1.3.3.1 材料表面生物被膜黏附性能測(cè)定

取上述基片于無(wú)菌離心試管中，用1 mL 0.9%生理鹽水清洗兩次以去除浮游菌，1 mL 1.0%結(jié)晶紫溶液中染色5 min后再用1 mL生理鹽水洗2 次去除浮色，加入體積分?jǐn)?shù)33%冰乙酸溶液0.2 mL脫色10 min，移取脫色后溶液于96 孔板中，用Victor X3酶標(biāo)儀測(cè)定OD595nm。

1.3.3.2 材料表面被膜菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取出菌懸液中培養(yǎng)一定時(shí)間后的基片，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，KH2PO40.27 g，Na2HPO41.42 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加去離子水定容到1 L）沖洗3 次去除浮游菌，再將基片放入10 mL磷酸鹽緩沖液中，于53 kHz、25 ℃條件下超聲處理10 min，梯度稀釋所得菌懸液，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定生物被膜上腐敗希瓦氏菌的菌落總數(shù)，繪制被膜菌生長(zhǎng)曲線。

1.3.3.3 材料表面被膜微觀形貌觀察

菌懸液中培養(yǎng)一定時(shí)間后的基片用無(wú)菌水沖洗3 次，放入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中浸漬4 h，而后分別在30%、50%、70%、90%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中浸泡30 min，在無(wú)水乙醇中浸泡1 h，取出后于超凈臺(tái)內(nèi)自然風(fēng)干。樣品噴金后，觀察其表面生物被膜的微觀形貌。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈦片、多孔鈦片及ZnO薄膜的表征分析

2.1.1 XRD、FTIR分析

圖1 ZnO薄膜的XRD（a）、FTIR（b）圖Fig. 1 XRD patterns (a) and FTIR spectra (b) of ZnO films

ZnO的微結(jié)構(gòu)影響ZnO薄膜的抗菌性。Shams等[25]發(fā)現(xiàn)納米粒子的形狀影響生物被膜的形成。Dutta等[26]發(fā)現(xiàn)ZnO的結(jié)晶狀態(tài)影響其抗菌性。與ZnO薄膜同時(shí)制備粉體的XRD表征結(jié)果表明，樣品為六角纖鋅礦結(jié)構(gòu)ZnO晶體（JCPDS card No.36-1451），2θ角在31.77°、34.43°、36.26°、47.55°、56.61°、62.88°、67.97°、72.59°處的衍射峰分別對(duì)應(yīng)ZnO晶體的（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（112）、（004）晶面。由圖1a可見(jiàn)，衍射峰峰形不夠尖銳，半峰寬較寬，33.40°

和59.82°處有較弱的雜質(zhì)峰，說(shuō)明樣品結(jié)晶度較低，晶體粒徑較小且有少量中間產(chǎn)物存在。采用謝樂(lè)公式計(jì)算晶體平均粒徑為8.0 nm。

由剝離ZnO薄膜的FTIR圖（圖1b）可見(jiàn)，3 500～3 300 cm－1處的寬吸收峰和1 580 cm－1處的強(qiáng)吸收峰分別對(duì)應(yīng)于—OH的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)，表明樣品中含有結(jié)合水和毛細(xì)孔水。2 362 cm－1處的吸收峰是由于樣品吸附了空氣中CO2引起的。948 cm－1和835 cm－1處的吸收峰是Zn—OH—Zn和Zn—OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，469 cm－1處的吸收峰是Zn—O彎曲振動(dòng)吸收峰。1 046 cm－1以及743、687 cm－1處的吸收峰為氫氧化鋅羥基（σ-OH）、（α-OH）的振動(dòng)吸收峰[27]，1344～1395 cm－1處歸屬于ZnO表面羥基或橋聯(lián)羥基的伸縮和彎曲振動(dòng)吸收峰，表明樣品中ZnO吸附了部分極性的—OH，且有少量含—OH的中間產(chǎn)物存在，與XRD分析結(jié)果一致。

2.1.2 材料表面微觀形貌分析

由圖2可見(jiàn)，鈦片表面有光滑的不規(guī)則筍狀突起，介于50～150 nm。鈦片經(jīng)陽(yáng)極氧化法處理后，表面形成孔徑約50 nm、深度約100 nm的TiO2多孔，排列均勻。經(jīng)sol-gel 1 次涂膜的多孔鈦片表面有少量ZnO顆粒沉積于孔道頂端，相互聚集且分布不均勻，同時(shí)可見(jiàn)孔道內(nèi)壁無(wú)ZnO顆粒沉積，ZnO薄膜約50 nm厚。經(jīng)4 次涂膜后，ZnO附著量明顯增大，少量ZnO顆粒進(jìn)入孔道內(nèi)壁，大量ZnO顆粒延孔壁頂端沉積，TiO2孔基本被覆蓋，且ZnO顆粒呈多層堆積結(jié)構(gòu)，“孔隙”增大。分析認(rèn)為，醋酸鋅的乙醇溶液和NaOH混合后發(fā)生了水解，加熱至80 ℃后促進(jìn)其水解反應(yīng)的發(fā)生，使Zn—O—Znn縮聚形成凝膠，干燥處理后，凝膠中的ZnO結(jié)晶析出，得六方纖鋅礦型ZnO[28]。在溶膠涂膜過(guò)程中，由于在真空條件下將多孔鈦片浸漬于溶膠中，則會(huì)有部分溶膠進(jìn)入孔中，脫水后沉積于孔的內(nèi)壁。而由于真空度有限，孔中尚有很多空氣，阻滯溶膠的進(jìn)入，故表現(xiàn)為大多數(shù)ZnO顆粒沉積于多孔鈦片表面。

圖2 鈦片及不同涂膜次數(shù)的ZnO薄膜SEM圖Fig. 2 SEM images of titanium sheet and ZnO films with different cycles of coating

圖3 多孔鈦片及涂膜4 次ZnO薄膜的TEM和SAED圖Fig. 3 TEM images and SAED patterns of titanium sheet and ZnO films with 4 cycles of coating

由圖3a、b可見(jiàn)，多孔鈦片的孔徑約為50 nm，孔壁厚約5 nm，排列規(guī)則，其SAED結(jié)果中可見(jiàn)銳鈦礦型TiO2（JCPDS card No.89-4921）的（101）、（004）、（200）、（105）、（211）晶面，說(shuō)明多孔鈦片表面為T(mén)iO2。這是由于陽(yáng)極氧化過(guò)程中鈦片表面聚集的O2－與Ti4+形成氧化膜，在電場(chǎng)作用下膜層表面發(fā)生場(chǎng)致氧化和場(chǎng)致溶解，進(jìn)而形成孔核，隨氧化時(shí)間延長(zhǎng)最終形成多孔結(jié)構(gòu)[29]。多孔鈦片經(jīng)sol-gel涂覆4 次后的薄膜中ZnO顆粒粒徑約5～10 nm，部分進(jìn)入TiO2孔中，部分于孔壁邊緣（圖3c），與SEM結(jié)果一致。其SAED結(jié)果中可見(jiàn)ZnO晶體（JCPDS card No.36-1451）的（100）、（002）、（101）、（102）、（110）晶面（圖3d），說(shuō)明樣品為六方纖鋅礦型ZnO，與XRD分析結(jié)果相符。

2.1.3 材料表面親疏水性表征

表1 鈦片及ZnO薄膜的水接觸角Table 1 Water contact angle of titanium sheet and zinc oxide films

由表1可見(jiàn)，鈦片表面呈親水性，而多孔鈦片表面呈疏水性，ZnO薄膜呈強(qiáng)親水性，且涂膜4 次ZnO薄膜的親水性更強(qiáng)。分析認(rèn)為，由于鈦片表面并不平整，存在較多不規(guī)則突起，在一定程度上增大了其表面液體與氣體的接觸面所占比例，故其接觸角較小，呈親水性。而多孔鈦片在與水接觸時(shí)，水滴無(wú)法與基底直接接觸，而與納米孔及納米孔中的空氣接觸，液滴與氣體接觸面積占比較大，故表現(xiàn)出較好的疏水性。由于納米ZnO粒徑小，且顆粒表面有毛細(xì)孔水和表面吸附水，且存在含有—OH的中間產(chǎn)物，使其親水性增強(qiáng)。隨著沉積次數(shù)增加，薄膜表面沉積的ZnO增多，故其親水性更強(qiáng)，表現(xiàn)為其水接觸角減小。

2.2 材料表面生物被膜附著性能分析

2.2.1 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜黏附率及被膜菌生長(zhǎng)曲線

由圖4可見(jiàn)，生物被膜開(kāi)始培養(yǎng)至2 h，材料表面生物被膜黏附率及被膜菌增長(zhǎng)較快，表明生物被膜從最初的可逆附著轉(zhuǎn)化為不可逆附著，經(jīng)歷了生化作用階段和菌體附著階段。在2～24 h范圍內(nèi)，被膜黏附率及被膜菌菌落總數(shù)增長(zhǎng)較快，表明生物被膜進(jìn)入生長(zhǎng)期。在24～36 h范圍內(nèi)，被膜黏附率增加緩慢，但被膜菌幾乎不變，表明生物被膜進(jìn)入成熟期，被膜菌代謝處于平衡狀態(tài)，活菌數(shù)量不再增加，而基片表面附著的多糖和蛋白質(zhì)及死亡菌體增多。36 h后，被膜黏附率和菌落總數(shù)開(kāi)始下降，生物被膜進(jìn)入衰退期。

圖4 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜的黏附率（a）及被膜菌生長(zhǎng)曲線（b）Fig. 4 Adhesion rate (a) and total number (b) of live cells of S. putrefaciens biofilms on surfaces

在生物被膜生長(zhǎng)的各個(gè)階段，鈦片表面的生物被膜黏附率和被膜菌數(shù)量均高于同期其他樣品，其次為多孔鈦片，而ZnO薄膜表面的生物被膜生長(zhǎng)緩慢，且涂膜4 次樣品的抗生物被膜性能最優(yōu)。鈦片表面無(wú)抗菌性物質(zhì)，且具有親水性，故有利于生物被膜的附著和被膜菌的生長(zhǎng)。而多孔鈦片表面形成了TiO2，且具有疏水性能，不利于生物被膜的早期黏附和被膜菌的生長(zhǎng)。故其表面的生物被膜黏附率明顯低于同期的鈦片，而其表面的被膜菌數(shù)量?jī)H略低于同期的鈦片，這是由于被膜黏附物質(zhì)少，不能為被膜菌提供充足養(yǎng)分所致。多孔鈦片涂覆ZnO薄膜后的樣品表面雖然具有很強(qiáng)的親水性，有利于生物被膜的初期黏附，但由于ZnO具有較強(qiáng)的抗菌性能，其表面生物被膜黏附率和被膜菌數(shù)量均較鈦片和多孔鈦片有較大幅度降低，且涂膜4次樣品的抗生物被膜性能更優(yōu)。ZnO納米粒子抗菌基于離子溶出機(jī)理，Zn2+溶出后進(jìn)入生物被膜內(nèi)，接觸菌體后與蛋白酶結(jié)合使之失去活性，進(jìn)而使細(xì)菌死亡[15,30]。當(dāng)被膜菌被殺死后，不再分泌被膜多糖等被膜黏附物，使生物被膜黏附率下降。同時(shí)，被膜黏附物質(zhì)減少也不利于被膜菌的生長(zhǎng)，使ZnO薄膜表面的被膜菌數(shù)量低于同期鈦片表面1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)。由于涂膜4 次的ZnO薄膜厚度達(dá)50～100 nm，其ZnO顆粒的沉積量遠(yuǎn)高于涂膜1 次的ZnO薄膜，故在生物被膜附著后，其Zn2+溶出較多，對(duì)被膜菌的殺菌能力更強(qiáng)，影響了被膜菌分泌生物被膜的黏附成分，表現(xiàn)為生物被膜的黏附率較低，同時(shí)可見(jiàn)，涂膜4 次的ZnO薄膜表面的被膜菌數(shù)量比涂膜1 次的ZnO薄膜低1 個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.2.2 材料表面腐敗希瓦氏菌生物被膜微觀形貌表征

圖5 不同時(shí)間段鈦片及涂膜次數(shù)不同的ZnO薄膜表面生物被膜的SEM圖Fig. 5 SEM images of biofilms on titanium sheet and zinc oxide films with different cycles of coating at different incubation times

由圖5可見(jiàn)，在生物被膜培養(yǎng)至第2小時(shí)，材料表面形成少量黏附多糖及蛋白質(zhì)膜，但未見(jiàn)菌落，表明生物被膜已黏附于材料表面，而被膜菌數(shù)量較少。培養(yǎng)至第12小時(shí)，各材料表面均可見(jiàn)黏附態(tài)生物被膜，且有形態(tài)完整的被膜菌（見(jiàn)圖中圈形標(biāo)注），說(shuō)明此時(shí)生物被膜進(jìn)入生長(zhǎng)階段。第36小時(shí)，材料表面的胞外多糖膜逐漸增厚，甚至有的將菌體包裹其中，說(shuō)明生物膜進(jìn)入成熟階段。第48小時(shí)，可見(jiàn)部分受損細(xì)胞及散落的黏附態(tài)物質(zhì)，黏附多糖形成的連續(xù)膜部分脫落，說(shuō)明此時(shí)已進(jìn)入生物被膜的衰退期。比較同期的生物被膜微觀形貌，鈦片與多孔鈦片表面的生物被膜黏附物較多，ZnO表面的被膜黏附物和菌體數(shù)量較少，與材料表面生物被膜黏附率及被膜菌生長(zhǎng)曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

鈦片陽(yáng)極氧化處理后得到多孔鈦片，多孔鈦片表面經(jīng)sol-gel法涂膜后得到六方纖鋅礦型ZnO薄膜，涂膜1 次的ZnO薄膜較薄，約50 nm，涂膜4 次后薄膜增厚至50～100 nm。薄膜中ZnO顆粒約5～10 nm，沉積于孔道頂端，相互聚集且分布不均勻。鈦片呈親水性，水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生物被膜在其表面生長(zhǎng)速率和附著量均較大；多孔鈦片呈疏水性，生物被膜在其表面的黏附率下降，但被膜菌生長(zhǎng)未受到顯著抑制。ZnO薄膜呈較強(qiáng)親水性能，但由于ZnO具有殺菌性能，其對(duì)被膜黏附及被膜菌生長(zhǎng)均有強(qiáng)抑制性能，且涂膜4 次所得ZnO薄膜對(duì)水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能最優(yōu)。