何立超，吳文敏，楊海燕，孫秀秀，彭偉明，岳麗莉，靳國(guó)鋒,*，馬美湖

（1.武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

生鮮肉由于其水分含量高、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，在屠宰、分割、加工等過程中極易受微生物污染，如沙門菌、大腸桿菌、李斯特菌等致病菌。因此，生鮮肉的殺菌保鮮對(duì)其貯藏品質(zhì)起著決定性的作用。關(guān)于生鮮肉殺菌保鮮方法的研究報(bào)道很多，主要包括物理法（如輻照[1-2]、超高壓殺菌[3]、超聲殺菌[4-5]、冷等離子體殺菌[6]、脈沖電場(chǎng)殺菌[7]等）和化學(xué)法（如使用乳酸[8-9]、CO2[10]等）。而輻照作為一種冷殺菌方式，能殺滅肉品內(nèi)部絕大部分甚至全部的微生物，被認(rèn)為是提高肉品衛(wèi)生安全性、延長(zhǎng)保質(zhì)期最有效的方法之一[11-12]。Robert等[13]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)3 kGy輻照后的生鮮牛肉，在4 ℃條件下可以貯藏42 d，而對(duì)照組未輻照的樣品只能貯藏7 d。我國(guó)1986年就出臺(tái)了《輻照食品衛(wèi)生管理規(guī)定（暫行）》，允許肉品進(jìn)行輻照處理，并在1994年制定了《輻照豬肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[14]。但是，到目前為止在我國(guó)輻照技術(shù)真正商業(yè)化用于生鮮肉的保鮮尚鮮見，其主要原因是肉類被輻照后會(huì)產(chǎn)生類似臭蛋味、血腥味、金屬味、燒焦味、硫磺味等輻照異味[15]，為消費(fèi)者所不能接受。已有研究證實(shí)，肉品輻照異味主要是由于輻照過程中蛋白質(zhì)發(fā)生氧化、降解有關(guān)。林若泰等[16]研究發(fā)現(xiàn)冷卻真空包裝豬肉γ-輻照后的異味成分主要是二甲硫、二甲二硫、甲硫醇等含硫揮發(fā)性化合物，且這些揮發(fā)性化合物主要來自于肌肉中的含硫氨基酸（半胱氨酸、蛋氨酸）以及VB1的輻照降解。Ahn等[17]認(rèn)為肉品輻照過程中含硫氨基酸側(cè)鏈容易發(fā)生降解形成異味化合物。但是，到目前為止大多數(shù)肉類輻照方面的研究還主要集中在輻照的殺菌效果和揮發(fā)性輻照異味化合物組成方面，而關(guān)于輻照過程中肌肉蛋白質(zhì)的降解情況研究很少。已經(jīng)有大量研究表明，食品中蛋白質(zhì)降解形成的一些小分子寡肽對(duì)食品的滋味有非常重要的影響[18]。

本研究主要通過分析豬肉輻照前后肌肉中蛋白質(zhì)降解形成小分子寡肽（＜3 kDa）的情況以及氨基酸組成變化情況探索輻照對(duì)生鮮豬肉蛋白質(zhì)降解的影響，為輻照技術(shù)在生鮮肉品中的應(yīng)用提供參考，同時(shí)也為將來進(jìn)一步研究輻照異味（滋味）形成機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬肉為雨潤(rùn)集團(tuán)公司當(dāng)日宰殺的豬后腿肉。

茚三酮、氨基酸分析用緩沖液（均為色譜純）日本日立公司；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品、三氟乙酸、甲酸（色譜級(jí)） 美國(guó)Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；QY-300電動(dòng)勻漿機(jī) 江蘇周莊科研器械廠；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；D-37520-3-30K高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Q ExactiveTM質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；60Co-γ輻照源（活度1.1×1016Bq） 湖北省輻照實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 方法

1.3.1 樣品輻照

將購(gòu)買的新鮮豬后腿肌肉去除結(jié)締組織及肉眼可見的脂肪，將其切成50 mm×40 mm×15 mm規(guī)格大小肉塊6 塊，將所有肉塊平均分成2 組，其中一組作為未輻照對(duì)照樣品，另一組進(jìn)行3 kGy γ-輻照（劑量率3.4 kGy/h）。輻照結(jié)束后樣品立即取樣進(jìn)行氨基酸及多肽組成的分析。

1.3.2 氨基酸組成分析

1.3.2.1 樣品酸水解

參考Galla等[19]的方法加以改進(jìn)。將對(duì)照組和不同劑量輻照處理的肉樣分別用絞肉機(jī)進(jìn)行絞碎處理，絞碎后分別稱取各處理組肉樣250 mg，裝入10 mL水解安瓿管中，緩慢加入8 mL 6 mol/L HCl溶液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)安瓿管，使樣品全部到達(dá)管底部，并保證樣品全部潤(rùn)濕后，保持恒穩(wěn)氣流充氮2 min，丁烷噴槍封口，馬弗爐（110±1）℃水解24 h。水解管取出冷卻后，用醫(yī)用磨刀石切開水解管，用去離子水全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，定容、搖勻，雙層濾紙過濾，取濾液1 mL置25 mL小燒杯中，在加有NaOH的真空干燥箱中蒸干（約50 ℃），加入1 mL pH 2.2的HCl溶液（或0.02 mol/L HCl溶液）毛細(xì)管攪拌溶解，于10 000 r/min離心10 min，最后經(jīng)0.22 μm水系微孔濾頭過濾，于樣品瓶中備用，低溫貯存（－20 ℃）待上機(jī)。

1.3.2.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取氨基酸混合標(biāo)樣0.24 mL，用0.2 mol/L HCl溶液定容至10 mL，Pro 6 nmol/50 μL，其余氨基酸單體3 nmol/50 μL，繪制梯度濃度，然后按樣品測(cè)定步驟進(jìn)行。

1.3.2.3 氨基酸分析程序與條件

分析程序采用Hitachi氨基酸全自動(dòng)分析儀蛋白質(zhì)分析標(biāo)準(zhǔn)程序，分析周期75 min。分析柱26 mm×150 mm；樹脂2619；緩沖液流速0.225 mL/min；茚三酮流速0.3 mL/min；茚三酮壓力25 kg/cm2；柱壓90 kg/cm2；柱溫53 ℃；N20.28 kg/cm2；洗脫液級(jí)數(shù)5 級(jí)；進(jìn)樣量50 μL；標(biāo)樣濃度3 nmol/50 μL。樣品中氨基酸含量的最終結(jié)果以肉質(zhì)量計(jì)（mg/100 g）。

1.3.3 多肽組成分析

1.3.3.1 小分子多肽提取

參考Ilko等[20]的方法，并作一定改進(jìn)。50 mL無菌離心管內(nèi)加入6 g肉樣和24 mL超純水，40 ℃振搖，靜置2 min后，均質(zhì)2 min，然后4 ℃、3 000×g離心30 min。離心結(jié)束后，取上清液過濾，得到微濾液（多肽粗提液）。獲得的微濾液再用截留分子質(zhì)量為5 kDa的超濾管以4 000×g進(jìn)行20 min的超濾離心，截留分子質(zhì)量小于3 kDa的多肽，得到相應(yīng)超濾流穿液。上述樣品超濾過程各超濾離心管以冰塊和泡沫盒全程孵育，確保所有樣品溫度不超過4 ℃。

分別取各管超濾流穿液5 mL，轉(zhuǎn)移至各新管，冷凍干燥處理48 h，完全去除水分，得到多肽粗提粉末。每一批多肽粗提粉末均用500 μL的超純水進(jìn)行復(fù)溶濃縮，之后分別轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中。每個(gè)EP管中分別加入1 mL乙腈，劇烈振蕩，靜置5 min，用于析出超濾不完全且分子質(zhì)量較大的蛋白和少量極性雜質(zhì)。之后上離心機(jī)，10 000×g離心5 min，充分聚集沉淀。對(duì)各EP管內(nèi)上清液做氮吹處理至溶液體積約500 μL，徹底去除加入的乙腈。剩余上清液采用針式過濾器和0.22 μm水系濾膜進(jìn)行過濾，用于濾去多余的脂肪乳（粒徑大于0.22 μm），得到目標(biāo)小分子多肽混合液。各EP管做好標(biāo)記后，充氮置換掉殘余空氣，扣蓋并以Bemis無菌膜（Parafilm M?）嚴(yán)格密封，置于－20 ℃冰箱，待進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析。1.3.3.2 多肽序列分析

采用Q Exactive?組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀對(duì)輻照組預(yù)處理多肽樣品進(jìn)行序列鑒定，詳細(xì)分級(jí)操作如下：

1）ZipTip μC-18微量層析柱用于純化多肽。潤(rùn)濕柱子：吸取10 μL乙腈重復(fù)2 次；酸化柱子：吸取10 μL 0.1%三氟乙酸溶液重復(fù)2 次；吸附樣本：吹吸樣本15 次；除雜質(zhì)：吸取10 μL 0.1%三氟乙酸溶液，重復(fù)2 次；洗脫樣本：吸取2～5 μL 0.1%三氟乙酸溶液-50%乙腈溶液，將此洗脫液轉(zhuǎn)入新EP管。

2）Empore? SPE Cartridges C18（standard density）柱純化多肽除鹽。SPE柱加1 mL甲醇活化柱料；加1 mL 0.1%甲酸除去甲醇；加5%乙腈-0.1%甲酸溶液平衡柱子；加入樣本（重復(fù)2 次）；加入5%乙腈-0.1%甲酸除鹽除雜，重復(fù)3 次；加入1 mL純乙腈洗脫到1.5 mL離心管，冷凍抽干。

3）多肽液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)。多肽樣品溶解液（0.1%甲酸溶液、2%乙腈溶液）溶解，充分振蕩渦旋，13 200 r/min、4 ℃離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到上樣管中，色譜上樣量5 μL。預(yù)裝柱（Acclaim PepMap RSLC，C18，300 μm×5 mm，5 μm，100 ?，Dionex）對(duì)上樣多肽液進(jìn)行脫鹽處理（0.1%三氟乙酸溶液洗滌柱子15 min），之后進(jìn)入C18樹脂分離柱（Acclaim PepMap，C18，75 μm×150 mm，3 μm，100 ?，Dionex）對(duì)混合多肽進(jìn)行分離，流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)80%乙腈溶液和體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸溶液（99∶1，V/V），流速300 nL/min，每個(gè)組分分析時(shí)間65 min。質(zhì)譜分析使用單一的全掃描質(zhì)譜Orbitrap（質(zhì)量掃描范圍m/z 400～1 500；分辨率140 000），分離后的肽段直接進(jìn)入質(zhì)譜儀Thermo Scientific Q Exactive進(jìn)行在線檢測(cè)，質(zhì)譜原始文件經(jīng)過MM File Conversion軟件處理轉(zhuǎn)換，得到MGF格式文件，然后用MASCOT（www.matrixscience.com）檢索Uniprot_Susscrofa數(shù)據(jù)庫(kù)。肽段分析圖譜進(jìn)一步通過國(guó)家國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST驗(yàn)證其可信度，獲得最終多肽序列。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

氨基酸檢測(cè)結(jié)果以 ±s表示，并用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。對(duì)于第0天各樣品的多肽數(shù)據(jù)，多肽結(jié)果通過序列比較，對(duì)來源于蛋白的同源肽段清除位點(diǎn)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)輻照前后的多肽清除位點(diǎn)，結(jié)果以表格和柱狀圖呈現(xiàn)。多肽組檢索參數(shù)設(shè)置為一級(jí)質(zhì)譜誤差2×10－5；二級(jí)質(zhì)譜誤差0.6 Da。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照前后豬肉氨基酸組成及差異分析

表1結(jié)果表明，輻照處理后樣品中大部分氨基酸的含量比對(duì)照組有顯著降低（P＜0.05），只有Vla、Pro 2 種氨基酸與對(duì)照組差異不顯著。在輻照后含量發(fā)生下降的氨基酸中Leu、Ile、Met、Glu、Thr、Ser、Cys最為明顯，這表明支鏈氨基酸（Leu、Ile）、含硫氨基酸（Met、Cys）和帶醇羥基的氨基酸（Ser、Thr）在輻照過程中最容易受輻照的影響。這可能主要與這些氨基酸的結(jié)構(gòu)有關(guān)，含硫氨基酸分子中的硫原子、Ser和Thr分子中的羥基，這些基團(tuán)更容易受輻照的影響。關(guān)于輻照對(duì)含硫氨基酸的影響，大量研究已經(jīng)證明輻照會(huì)使肉品中的含硫氨基酸發(fā)生顯著降解，形成一些含硫的水溶性輻照異味化合物[21]。Ahn等[22]通過對(duì)單體氨基酸進(jìn)行輻照實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)脂肪族的Ile、Leu和Val是所有非含硫氨基酸中最容易受輻照影響的氨基酸，輻照能促使它們發(fā)生Strecker降解反應(yīng)，分別形成2-甲基-丁醛、3-甲基-丁醛以及2-甲基丙醛；其次是脂肪族羥基氨基酸Ser和Thr，它們經(jīng)過輻照后會(huì)形成大量的乙醛和丙醛。在肉品輻照過程中，氨基酸含量的變化還與蛋白質(zhì)的水解有關(guān)，但是本研究中所有的氨基酸含量輻照后都呈不同程度的下降，這表明3 kGy劑量輻照還不足以使肌肉蛋白質(zhì)徹底水解形成氨基酸，更多的可能是形成一些多肽。

表1 輻照前后樣品中的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of pork meat before and after irradiation

2.2 輻照前后豬肉中多肽組成及差異分析

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道分子質(zhì)量小于3 kDa的小分子肽對(duì)食品的滋味有重要影響，是食品滋味的重要貢獻(xiàn)者[23-24]。因此，本研究輻照結(jié)束后，通過超濾的方法提取肌肉中分子質(zhì)量小于3 kDa的寡肽，然后對(duì)其進(jìn)行高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)分析，表2表明，肌肉經(jīng)輻照后共產(chǎn)生分子質(zhì)量小于3 kDa的多肽104 種，分別來源于21 種不同的肌肉蛋白質(zhì)。對(duì)104 條多肽進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些多肽中最大分子質(zhì)量為2 888 Da，來自Importin 13 OS=Susscrofa；最小分子質(zhì)量為670 Da，來自肌鈣蛋白I。通過對(duì)不同分子質(zhì)量小分子肽頻率分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，由圖1可知，3 kGy輻照后生成的小分子肽分子質(zhì)量主要集中在1 200～2 600 Da之間，占到了輻照產(chǎn)生的小分子肽總量的76%。

表2 新鮮豬肉經(jīng)輻照（3 kGy）顯著產(chǎn)生的小分子多肽序列Table 2 Major small molecular polypeptides in fresh pork produced after 3 kGy irradiation

續(xù)表2

續(xù)表2

圖1 3 kGy輻照后形成小分子肽的分子質(zhì)量分布Fig. 1 Molecular mass distribution of small peptides produced after 3 kGy irradiation

2.3 輻照后產(chǎn)生多肽的總體分布

根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合BLAST驗(yàn)證表2中所有21 種蛋白序列號(hào)，并統(tǒng)計(jì)各種多肽的組織來源分布，如表3所示。

通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)鑒定到的104 種多肽中，53%來自于肌肉結(jié)構(gòu)蛋白降解，其中15.4%的多肽來源于肌聯(lián)蛋白，6.7%的多肽來源于伴肌動(dòng)蛋白，8.6%的多肽來源于肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I。其中，肌鈣蛋白T產(chǎn)生的輻照小分子肽（6.7%）顯著多于肌鈣蛋白I產(chǎn)生的輻照小分子肽（1.9%）（P＜0.05）。另外4.8%多肽來源于肌間線蛋白，5.8%來源于肌收縮蛋白，2個(gè)擁有LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白——LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白3和輔肌動(dòng)蛋白相關(guān)LIM蛋白1a產(chǎn)生小分子肽的比例則分別占到了8.7%和2.9%。據(jù)報(bào)道，LIM蛋白的LIM結(jié)構(gòu)域往往與肌動(dòng)蛋白纖維以及肌纖維的Z-線相聯(lián)系，而肌收縮蛋白也是分布于肌節(jié)Z-線上一種重要纖維外結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，往往和肌動(dòng)蛋白及α-輔肌動(dòng)蛋白相互結(jié)合作用[25]。因此，肌原纖維內(nèi)骨架蛋白（肌聯(lián)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I）的有限降解對(duì)輻照小分子肽具有突出貢獻(xiàn)（30.7%），而肌原纖維外骨架蛋白如肌間線蛋白、肌收縮蛋白和肌肉LIM結(jié)構(gòu)域蛋白對(duì)輻照小分子肽的貢獻(xiàn)（22.2%）要低于肌原纖維內(nèi)骨架蛋白（30.7%），這可能主要與其在肌肉中的含量以及水解敏感性有關(guān)。陳韜等[26]報(bào)道肌聯(lián)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白都是在肌原纖維蛋白中含量比較高且很容易發(fā)生水解的蛋白質(zhì)。

表3 輻照（3 kGy）顯著產(chǎn)生的小分子多肽來源及分布比例Table 3 Origin and distribution proportions of major small molecular peptides in pork produced after 3 kGy irradiation

輻照（3 kGy）不僅造成肌肉本身結(jié)構(gòu)蛋白的降解，而且還在一定程度上降解了其他類型蛋白質(zhì)，形成的小分子多肽占總多肽含量31.8%。如突觸融合蛋白3同源體、突觸足蛋白2、核質(zhì)穿梭轉(zhuǎn)運(yùn)體13、熱休克蛋白β-1、鉀離子電壓閥門通道-亞型蛋白家族A成員1蛋白、核孔復(fù)合體蛋白Nup85、視松蛋白和一種Goosecoid同源框蛋白，它們占總多肽比例分別為10.6%、6.7%、3.8%、4.8%、2.9%、1%、1%和1%。這說明肌肉中其他類型非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)的降解也在很大程度上貢獻(xiàn)了輻照風(fēng)味。

而肌漿蛋白質(zhì)主要包括肌紅蛋白和參與肌肉收縮功能反應(yīng)的酶蛋白，例如糖酵解酶系、三羧酸循環(huán)及脂肪酸β-氧化酶系、氧化磷酸化酶系、電子傳遞體有關(guān)酶系等。而本研究也發(fā)現(xiàn)了5 類可能對(duì)輻照小分子肽有貢獻(xiàn)的酶系，它們包括細(xì)胞色素b、巖藻糖激酶、乳糖酶-根皮苷水解酶、磺基轉(zhuǎn)移酶和一種PI3 C α-蛋白酶抑制劑，它們分別占到小分子肽含量的3.8%、3.8%、3.8%、1.9%和1.9%，總共貢獻(xiàn)了15.2%的小分子肽。

2.4 輻解（3 kGy）顯著產(chǎn)生的風(fēng)味多肽中疏水性氨基酸分布

圖2 疏水性多肽數(shù)量與序列中疏水性氨基酸比例關(guān)系圖Fig. 2 Relationship between the proportion of hydrophobic amino acids and the number of major hydrophobic peptides produced after 3 kGy irradiation

圖3 強(qiáng)疏水性多肽數(shù)量與序列中強(qiáng)疏水性氨基酸比例關(guān)系圖Fig. 3 Relationship between the proportion of highly hydrophobic amino acids and the number of major highly hydrophobic peptides produced after 3 kGy irradiation

文獻(xiàn)報(bào)道疏水性氨基酸在多肽中的組成及位置都會(huì)影響多肽風(fēng)味[27-29]。為進(jìn)一步探究輻照處理降解肌肉蛋白質(zhì)影響其風(fēng)味的規(guī)律，分析3 kGy輻照后產(chǎn)生的多肽中疏水性氨基酸的分布情況。從圖2可知，57.02%（65 種）多肽序列中疏水性氨基酸的比例超過了50%。根據(jù)氨基酸疏水值的高低，疏水值高于0.8以上的ILe、Leu、Vla、Phe、Trp歸類為強(qiáng)疏水值氨基酸，低于0.8的Phe、Met、Pro等歸類為低疏水值氨基酸[30]。圖3表明，輻照風(fēng)味肽強(qiáng)疏水性氨基酸的比例較低，其中76.32%（87 種）多肽序列中強(qiáng)疏水性氨基酸的比例不超過40%。這說明肌肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的輻解過程中，低疏水性和親水性的肽段更容易受到粒子轟擊而掉落下來，而這些低疏水性或親水性多肽可能對(duì)輻照滋味和輻照異味起重要作用。而在肌肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的輻解過程中，輻照風(fēng)味肽強(qiáng)疏水性氨基酸占比相對(duì)較少，可能是強(qiáng)疏水性氨基酸在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成了疏水核心，不易暴露降解造成的。

3 結(jié) 論

輻照處理后樣品中大部分氨基酸的含量比對(duì)照組有顯著降低。其中支鏈氨基酸（Leu、Ile）、含硫氨基酸（Met、Cys）和帶醇羥基的氨基酸（Ser、Thr）在輻照過程中最容易受輻照影響而降解。肌肉輻照產(chǎn)生的分子質(zhì)量小于3 kDa的多肽主要集中在1 200～2 600 Da范圍內(nèi)，占到了原始多肽總量的76%。肌肉中不同蛋白質(zhì)對(duì)輻照敏感性不同，其中，肌原纖維結(jié)構(gòu)蛋白經(jīng)輻解產(chǎn)生的小分子肽超過了全部肽總量的50%，且肌聯(lián)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白、肌間線蛋白、肌鈣蛋白和LIM蛋白這5種肌肉結(jié)構(gòu)蛋白受3 kGy輻照顯著降解；而肌漿蛋白中的酶系經(jīng)3 kGy輻照后僅產(chǎn)生很少量的小于3 kDa的多肽。