陳 蕾 卞 瑤 周 旭 婁 宇 依 朋 王宏偉

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 大連116081)

帶形蜈蚣藻(Grateloupia turuturuYamada)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)、海膜目(Halymeniales)、海膜科(Halymeniaceae)、蜈蚣藻屬(GrateloupiaC.Agardh)。藻體單生或叢生, 鮮紅色, 新鮮的藻體黏滑, 高40—100 cm, 寬4—15 cm。一般藻體單條如帶狀, 但有的基部或上部分裂為1—2條以上的小裂片, 邊緣呈波浪形, 有的邊緣還生出小羽枝, 藻體基部形成細(xì)小的短柄, 具有圓盤狀的固著器。一般生長在低潮帶巖石上或石沼中, 廣泛分布于我國各地沿海, 在黃、渤海全年可見[1,2]。

帶形蜈蚣藻中含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及其他礦物質(zhì)[3]。藻紅蛋白是海藻中重要的光捕獲蛋白, 帶形蜈蚣藻中R-藻紅蛋白的含量極其豐富[4,5]。另外, 帶形蜈蚣藻富含大量卡拉膠以及多糖[6,7]。帶形蜈蚣藻的代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤方面的活性, 目前其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)鑒定和抗病毒活性等方面的研究已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[8—11]。Shanmugam等[12]曾經(jīng)報(bào)道了從帶形蜈蚣藻中提取的卡拉膠具有抗凝血的活性。帶形蜈蚣藻不僅在醫(yī)學(xué)藥品方面具有潛在的利用價(jià)值[13—16], 而且可作為一種副食品, 每逢繁殖季節(jié), 沿海居民多采收食用[17]。帶形蜈蚣藻作為大型經(jīng)濟(jì)海藻, 為了滿足市場需求, 研究如何大規(guī)模人工育苗、養(yǎng)殖也成為熱點(diǎn)。

帶形蜈蚣藻的早期發(fā)育類型為間接盤狀體型,生活史為典型同型世代交替。帶形蜈蚣藻囊果為球狀, 囊果中的雙倍體融合的細(xì)胞能產(chǎn)生果孢子。果孢子發(fā)育成四分孢子體, 經(jīng)減數(shù)分裂產(chǎn)生四分孢子。四分孢子萌發(fā)形成雌、雄配子體[18]。帶形蜈蚣藻絲狀體并不是其生活史中的一個(gè)階段, 但有學(xué)者在培養(yǎng)過程中多次觀察到, 如魏曉嬌[19]和Wei等[20]通過顯微鏡觀察到了帶形蜈蚣藻絲狀體在室內(nèi)條件下發(fā)育成盤狀體的具體過程, 并得到了盤狀體形成的最適溫度以及盤狀體發(fā)育成直立枝的最適條件。張澤宇等[21]采用盤狀體剝離法獲得蜈蚣藻絲狀體, 又采用絲狀體切斷法進(jìn)行采苗, 經(jīng)過2個(gè)月的室內(nèi)培養(yǎng), 成功生長出蜈蚣藻幼苗。

最近在培養(yǎng)帶形蜈蚣藻絲狀體過程中, 我們發(fā)現(xiàn)其絲狀體能形成孢子囊并釋放孢子, 將該孢子暫命名為“盤絲體孢子”。目前, 帶形蜈蚣藻絲狀體形成孢子的現(xiàn)象、機(jī)制及溫度、光照強(qiáng)度等環(huán)境因子對(duì)其形成、放散的影響均沒有報(bào)道。因此, 我們?cè)敿?xì)觀察了盤絲體孢子的形成過程, 并研究溫度及光照強(qiáng)度對(duì)帶形蜈蚣藻絲狀體中類單孢子放散的影響, 得到了實(shí)驗(yàn)室條件下帶形蜈蚣藻絲狀體盤絲體孢子形成、放散的最適溫度及光照強(qiáng)度。

本研究補(bǔ)充了帶形蜈蚣藻絲狀體的無性繁殖過程, 為帶形蜈蚣藻的種質(zhì)保存、人工育苗及養(yǎng)殖技術(shù)提供新的技術(shù)支撐, 同時(shí)為探討帶形蜈蚣藻以及蜈蚣藻屬的起源與演化提供新思路與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料采集和預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)用的帶形蜈蚣藻雌配子體于2016年11月12日采自遼寧省大連市黑石礁的低潮帶石沼中(圖 1),用盛有海水的保溫箱, 將其帶回實(shí)驗(yàn)室。

預(yù)處理過程參考曹翠翠等[22]的處理方法: 先用滅菌海水沖洗藻體數(shù)次, 在解剖鏡下用解剖針和軟毛刷去除藻體表面泥沙、附生性雜藻、原生動(dòng)物等附著物, 最后再用滅菌海水將其沖洗數(shù)次。選取完整、生長情況良好的具有囊果的雌配子體在室溫通風(fēng)處陰干1h, 以刺激孢子放散。將玻璃缸(20 cm×10 cm×10 cm)滅菌后, 在底部鋪滿已滅菌的載玻片,放入帶有成熟囊果的帶形蜈蚣藻雌配子體, 裝入500 mL滅菌海水, 置于培養(yǎng)條件為溫度16℃, 光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2.s), 光照周期為L∶D=10∶14的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)。待有大量果孢子放散出來后, 將附有果孢子的載玻片轉(zhuǎn)移到滅菌培養(yǎng)皿中, 向培養(yǎng)皿中加入2/3 體積的PES (Provasoli's enriched Seawater Medium)培養(yǎng)液, 另加入GeO2(2 mg GeO2/1 L PES)以防止附生硅藻的生長, 隔天更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至盤狀體時(shí)期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 絲狀體的形成與擴(kuò)增

將帶形蜈蚣藻盤狀體置于溫度為20℃, 光照強(qiáng)度為90 μmol/(m2.s), 光照周期為L∶D=10∶14的培養(yǎng)箱內(nèi), 培養(yǎng)15d, 在顯微鏡下觀察到盤狀體細(xì)胞逐漸伸長, 長出自由絲狀體。

在此培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)10d, 以獲得足量的成熟絲狀體用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 盤絲體孢子的形成與放散

將成熟絲狀體放在鋪滿載玻片、裝有PES培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中, 置于溫度為16℃, 光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2.s), 光照周期為L∶D=10∶14的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi), 培養(yǎng)48h后取出載玻片并用滅菌海水輕微沖洗,在10×10倍光學(xué)顯微鏡(Nikon 216987)下觀察到絲狀體內(nèi)產(chǎn)生多室孢子囊、并放散出大量盤絲體孢子, 拍照記錄。

圖 1 帶形蜈蚣藻野外生境(雌配子體)Fig. 1 Habitat of Grateloupia turuturu from Heishijiao, Dalian (Female gametophyte of G. turuturu)

1.4 盤絲體孢子放散條件的設(shè)置

溫度設(shè)置: 將成熟絲狀體分別置于溫度為6、12、16、20、24、30℃, 光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2.s),光照周期L∶D=10∶14的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(共6個(gè)梯度,每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行樣本)。

光照強(qiáng)度設(shè)置: 將成熟絲狀體分別置于光照強(qiáng)度為10、30、45、60、90和120 μmol/(m2.s), 溫度為15℃, 光照周期L∶D=10∶14的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(共6個(gè)梯度, 每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行樣本)。

1.5 盤絲體孢子放散觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將培養(yǎng)皿滅菌后并編號(hào), 培養(yǎng)皿中鋪滿已滅菌的載玻片, 裝入等量培養(yǎng)液后, 用鑷子夾取等量絲狀體放入培養(yǎng)液中, 開始計(jì)時(shí)。在放散附著后的12h、24h、48h和72h時(shí)將載玻片取出, 用滅菌海水輕微沖洗載玻片, 放在10×10倍光學(xué)顯微鏡(Nikon 216987)下觀察, 視野半徑r=0.80 mm, 隨機(jī)選取十個(gè)視野, 記錄每個(gè)視野的孢子數(shù), 求平均值A(chǔ)。盤絲體孢子放散密度的計(jì)算公式為: 盤絲體孢子放散量(個(gè)/mm2)=A/(πr2)。

2 結(jié)果

2.1 帶形蜈蚣藻絲狀體及盤絲體孢子的形成過程

帶形蜈蚣藻雌配子體表面小斑點(diǎn)狀的囊果(圖 2a),在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)約24h, 放散出果孢子附著在藻體下方載玻片上, 近球形, 直徑為5—10 μm (圖2b), 果孢子附著后48h內(nèi)果孢子的原生質(zhì)體向一側(cè)凹陷, 另一端向外凸起并形成萌發(fā)管, 原生質(zhì)體向萌發(fā)管轉(zhuǎn)移, 并在原地形成空泡(圖 2c)。培養(yǎng)到第3天時(shí), 隨著細(xì)胞分裂, 空泡逐漸變小、消失, 形成多細(xì)胞團(tuán)(圖 2d)。當(dāng)出現(xiàn)頂細(xì)胞和基細(xì)胞分化時(shí),進(jìn)入盤狀體時(shí)期(圖 2e), 隨后盤狀體逐步增大、融合, 發(fā)育速度變緩, 形狀呈不規(guī)則的橢圓形(圖 2f)。培養(yǎng)到第22—28天時(shí), 盤狀體上產(chǎn)生絲狀體(圖 2g),并且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增多, 絲狀體逐漸變長(圖 2h)。進(jìn)一步觀察, 在絲狀體上可清晰地看到盤絲體孢子(圖 2i)。將絲狀體在不同溫度及光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng), 觀察盤絲體孢子放散過程(圖 2j-k)及其最終形態(tài)(圖 2l)。

圖 2 帶形蜈蚣藻絲狀體中盤絲體孢子形成過程及放散附著Fig. 2 The filaments forming process, release and attachment of disc-filamentospores of Grateloupia turuturu

2.2 溫度對(duì)絲狀體盤絲體孢子放散的影響

帶形蜈蚣藻絲狀體釋放盤絲體孢子受溫度影響, 當(dāng)溫度在12—24℃, 均有盤絲體孢子放散, 溫度小于12℃或大于24℃時(shí), 盤絲體孢子的放散現(xiàn)象不明顯。盤絲體孢子的放散量與放散時(shí)間成正比。如圖 3、圖 4所示, 在放散72h后, 溫度為6℃時(shí), 由于低溫的脅迫, 盤絲體孢子放散量極少, 為3.53個(gè)/mm2(圖 3b); 溫度為12℃時(shí)盤絲體孢子的放散量溫度為18.97個(gè)/mm2; 16℃時(shí)的放散量有最大值, 達(dá)到28.65個(gè)/mm2(圖 3a); 當(dāng)溫度為20℃時(shí)盤絲體孢子的放散量為17.55個(gè)/mm2; 溫度為30℃時(shí), 由于高溫的脅迫, 盤絲體孢子放散量也極少, 僅有6.17個(gè)/mm2。這說明絲狀體盤絲體孢子放散適宜的溫度為12—20℃, 最適溫度為16℃。

2.3 光照強(qiáng)度對(duì)絲狀體盤絲體孢子放散的影響

光照強(qiáng)度條件對(duì)帶形蜈蚣藻絲狀體釋放盤絲體孢子具有影響。當(dāng)光照強(qiáng)度為10 和120 μmol/(m2.s)時(shí)(圖 5b), 只有極少盤絲體孢子完成放散與附著, 當(dāng)光照強(qiáng)度為30、45、60和90 μmol/(m2.s)時(shí)盤絲體孢子均能完成放散附著, 但放散與附著量存在一定的差異, 其放散量分別為16.31、22.48、29.97 和21.60個(gè)/mm2(圖 5a)。如圖 6所示, 盤絲體孢子的放散附著量在30—60 μmol/(m2.s)隨著光照強(qiáng)度的升高而增大, 在光照強(qiáng)度大于60 μmol/(m2.s)有下降的趨勢。在60 μmol/(m2.s)條件下盤絲體孢子的放散附著有最大量, 因此適宜盤絲體孢子放散與附著的光照強(qiáng)度范圍為30—90 μmol/(m2.s), 高光強(qiáng)和低光強(qiáng)均抑制其放散附著。

3 討論

圖 3 培養(yǎng)72h后不同溫度下帶形蜈蚣藻盤絲體孢子放散附著情況Fig. 3 Result of different temperature on disc-filamentospores releasing of Grateloupia turuturu after culturing 72h

圖 4 不同溫度下盤絲體孢子的放散量Fig. 4 Result of different temperature on disc-filamentospores releasing of Grateloupia turuturu

在自然條件下, 帶形蜈蚣藻通過果孢子和四分孢子進(jìn)行繁殖和擴(kuò)增, 1995年馬凌波等[17]對(duì)帶形蜈蚣藻(G. turuturu)等3種藻體進(jìn)行了室內(nèi)培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)這3種海藻四分孢子和果孢子在實(shí)驗(yàn)室條件下均可發(fā)育成幼苗。在海藻養(yǎng)殖領(lǐng)域, 通常以絲狀體為主要原料進(jìn)行人工育苗。帶形蜈蚣藻絲狀體易于獲得, 可以從帶形蜈蚣藻孢子的萌發(fā)、盤狀體的再生和直立枝的再生3種途徑得到[18,23]。本研究通過誘導(dǎo)帶形蜈蚣藻果孢子發(fā)育形成的盤狀體, 得到大量絲狀體。

在帶形蜈蚣藻早期發(fā)育的研究中, 關(guān)于絲狀體形成孢子的現(xiàn)象還未見報(bào)道。目前真紅藻亞綱其他藻類也均未見有關(guān)絲狀體放散孢子的報(bào)道。近期, 在培養(yǎng)帶形蜈蚣藻絲狀體過程中, 我們首次發(fā)現(xiàn)其絲狀體能產(chǎn)生多室孢子囊, 并放散出大量盤絲體孢子。該現(xiàn)象與壇紫菜 (Pyropia haitanensis)、條斑紫菜 (P. yezoensis) 等一些原紅藻亞綱藻類的自由絲狀體可形成孢子囊枝, 釋放殼孢子有相似之處。再加上帶形蜈蚣藻體型較大藻體單條如帶狀,邊緣呈波浪形, 相比于等其他真紅藻亞綱藻類, 帶形蜈蚣藻在形態(tài)學(xué)上與條斑紫菜更為相似。在此基礎(chǔ)上, 我們產(chǎn)生了新思考: 帶形蜈蚣藻與原紅藻亞綱藻類是否存在親緣關(guān)系? 在真紅藻類的進(jìn)化發(fā)展中, 帶形蜈蚣藻是否較早出現(xiàn)? 本研究為探討真紅藻亞綱的起源與進(jìn)化提供新思路。針對(duì)帶形蜈蚣藻其他來源的絲狀體, 以及蜈蚣藻屬其他藻類能否形成和放散孢子, 我們將深入研究并在分子水平使用系統(tǒng)學(xué)手段比較帶形蜈蚣藻盤絲體孢子的形成機(jī)制。

在對(duì)藻類生長發(fā)育的研究過程中, 溫度和光照強(qiáng)度是應(yīng)用較多的誘導(dǎo)因子。溫度對(duì)孢子的放散有直接影響, 不同藻類絲狀體中孢子放散的最適溫度也有差異, 褐藻門的萱藻 (Scytosiphon lomentarius) 絲狀體中孢子放散的適宜溫度范圍是7—23℃[24]; 17—21℃適于壇紫菜殼孢子的形成[25];條斑紫菜絲狀體中殼孢子的放散的最適溫度是17℃[26]。在本研究中, 帶形蜈蚣藻絲狀體中盤絲體孢子放散在12—24℃之間均可發(fā)生, 但當(dāng)溫度低于12℃時(shí), 由于受到明顯的低溫脅迫, 使其盤絲體孢子幾乎不能正常放散; 當(dāng)溫度高于24℃時(shí), 由于受到高溫脅迫, 盤絲體孢子的釋放也受到明顯的抑制。其中在12—24℃內(nèi), 最適溫度為16℃, 在此溫度下, 盤絲體孢子釋放量達(dá)到最大。當(dāng)設(shè)置的放散溫度低于絲狀體誘導(dǎo)成熟溫度時(shí), 往往具有很好的放散效果, 這一點(diǎn)與紫菜殼斑藻的殼孢子放散的規(guī)律具有相似性[27]。

圖 5 培養(yǎng)72h后不同光照強(qiáng)度下帶形蜈蚣藻盤絲體孢子放散附著情況Fig. 5 Result of different irradiance on disc-filamentospores releasing of Grateloupia turuturu after culturing 72h

圖 6 光照強(qiáng)度對(duì)帶形蜈蚣藻盤絲體孢子放散的影響Fig. 6 Effect of irradiance on disc-filamentospores releasing of Grateloupia turuturu

光照強(qiáng)度作為大型海藻生長繁殖發(fā)育的影響因素, 對(duì)藻類孢子的放散也有一定的影響。在不同海藻中, 孢子放散的最適光照強(qiáng)度也存在一定差異,如: 萱藻絲狀體孢子放散的最適光照強(qiáng)度為72 μmol/(m2.s)[24]; 當(dāng)光照強(qiáng)度為40 μmol/(m2.s)時(shí), 壇紫菜孢囊枝量最多、殼孢子形成量達(dá)到最大值[25]。在本研究中, 當(dāng)光照強(qiáng)度小于10 μmol/(m2.s)或者大于120 μmol/(m2.s)時(shí), 帶形蜈蚣藻絲狀體中, 盤絲體孢子的放散明顯受到抑制。當(dāng)光照強(qiáng)度在30—90 μmol/(m2.s)內(nèi), 盤絲體孢子均可放散, 但放散量存在一定差異。當(dāng)光照強(qiáng)度為60 μmol/(m2.s)時(shí), 放散量有最大值。由此可知, 放散的光照強(qiáng)度適宜范圍為30—90 μmol/(m2.s), 60 μmol/(m2.s)為最適光照強(qiáng)度。

帶形蜈蚣藻的絲狀體發(fā)育成成熟藻體不受季節(jié)限制, 在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)成本較低且周期較短,絲狀體的應(yīng)用前景非常廣闊, 利用絲狀體進(jìn)行人工育苗、養(yǎng)殖已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。在本研究中, 我們首次發(fā)現(xiàn)帶形蜈蚣藻絲狀體能夠形成孢子, 關(guān)于該孢子的形成機(jī)制、其繼續(xù)發(fā)育成盤狀體還是絲狀體, 或者是直接形成幼苗等問題, 以及在系統(tǒng)演化中的作用, 需要進(jìn)行詳細(xì)的研究。