曾曉鵬 徐錦濤 鄧子權(quán) 方逸麟 何銘華 夏建榮

(廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 廣州 510006)

硅藻作為海洋浮游植物的重要類群, 貢獻了近20%的全球初級生產(chǎn)力[1,2]。硅藻通過光合作用將溶解性無機碳(Dissolved inorganic carbon, DIC)轉(zhuǎn)移到深海的過程是全球海洋生物泵的重要組成部分[3], 對全球碳循環(huán)具有重要的意義。由于水氣界面的存在, CO2在海水中的擴散速率是緩慢的, 導(dǎo)致了海水中CO2濃度僅為海洋硅藻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco) K1/2(CO2)的1/4—1/3[4—6],但大部分的硅藻擁有CO2濃縮機制(CO2Concentrating Mechanisms, CCMs), 用于克服海洋環(huán)境中低CO2濃度對光合作用的限制[7,8]。在工業(yè)革命后,人為排放CO2不斷的增加, 預(yù)計到2100年大氣中的CO2濃度將會達到1000 ppmv[9], 而大氣中的CO2有近1/3被海洋吸收并導(dǎo)致表層海水pH下降0.3, 出現(xiàn)海洋酸化的現(xiàn)象[10,11]。海洋酸化將導(dǎo)致海水中CO2和濃度增加, 對海洋浮游植物的初級生產(chǎn)力和浮游植物的群落結(jié)構(gòu)造成影響[12,13], 這種影響可能是正面的也可能是負面的[14,15]。在高濃度CO2條件下培養(yǎng)的藻會通過下調(diào)CCMs活性來節(jié)省CCMs運行過程中的能量消耗, 而在低濃度CO2條件下培養(yǎng)的藻細胞則通過增強CCMs活性以獲取更多碳源用于光合作用[13,16,17]。

硅藻CCMs的運行是個耗能的過程, 其活性不僅取決于外部無機碳(Inorganic carbon, Ci)濃度, 還與光能的獲取有著密切的聯(lián)系[5,18]。藻類的光合作用為Ci的轉(zhuǎn)運提供能量, 對CCMs的活性具有直接的影響[19—21]。光和CO2濃度是2個重要的環(huán)境因子,其對藻類的相互作用會影響藻類的光合生理和海洋生態(tài)環(huán)境[22]。在酸化和200 μmol photons/(m2.s)的光強下, 三角褐指藻能夠減少CCMs運行過程中的能量支出, 并將這部分能量用于細胞的增長[16]。此外, CO2和光強的交互作用還會對浮游植物群落造成影響。當(dāng)CO2濃度升高時, 低光強能夠促進浮游植物群落的生長和碳的固定, 而在高光強下浮游植物群落初級生產(chǎn)力下降[23]。光和CO2對藻的生長和光合特性的影響是存在差異的, 涉及藻類對光和海洋酸化的響應(yīng)機制還需要進一步探索[15,22]。

本文利用海洋浮游硅藻的模式藻種三角褐指藻作為實驗材料, 通過測定不同光強和CO2濃度下三角褐指藻光合生理、碳酸酐酶(Carbonic anhydrase, CA)和Rubisco活性的變化, 探討光強和CO2濃度對于三角褐指藻CCM的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

三角褐指藻bac-2 (Phaeodactylum tricornutumBohlin)取自中國科學(xué)院海洋研究所。藻細胞被培養(yǎng)在f/2加富的天然海水中, 溫度為(20±1)℃, 設(shè)置高、低光的光強分別為160和50 μmol photos/(m2.s),培養(yǎng)液的pH分別控制在7.80±0.05、8.00±0.05和8.20±0.05, 相當(dāng)于CO2濃度分別為25 μmol/L (High carbon dioxide concentration, HC)、16 μmol/L (Medium carbon dioxide concentration, MC)和11 μmol/L(Low carbon dioxide concentration, LC)。三角褐指藻的接種起始密度為500 cell/mL, 通過添加飽和CO2海水以維持培養(yǎng)液中pH。培養(yǎng)至18—20代后用0.45 μm聚酰胺濾紙過濾收集用于實驗。

1.1 海水碳酸鹽化學(xué)

通過滴定法測定海水[溫度: (20±1)℃; 鹽度:30‰]的總堿度(Total alkalinity, TA)[24,25]。通過TA、pH和硼酸濃度計算培養(yǎng)液中的碳酸堿度[26],CO2的濃度通過碳酸堿度計算獲得[27]。

1.2 生長測定

用血球計數(shù)板在顯微鏡下對藻細胞進行計數(shù)。比生長速率(Specific growth rate, SGR)通過以下公式計算:μ=(lnX2-lnX1)/(T2-T1), 其中,X1和X2分別代表三角褐指藻在T1和T2時的細胞密度。

1.3 光合作用測定

采用Clark型氧電極(YSI 5300A, YSI, USA)在400 μmol photons/(m2.s)的光強下測定藻細胞的凈光合放氧速率。用恒溫循環(huán)水浴連接反應(yīng)槽, 使反應(yīng)槽中的溫度維持在(20±0.1)℃, 測定過程中三角褐指藻的細胞密度約為6.0×106cell/mL。

1.4 可溶性蛋白含量測定

用考馬斯亮藍G-250染料結(jié)合法測定可溶性蛋白(Soluble protein, SP)含量[28]。將培養(yǎng)樣品在4℃,12000×g的條件下離心3min收集藻細胞。在收集的藻細胞中加入5 mL的蒸餾水, 然后用超聲波細胞破碎儀破碎藻細胞, 并在5000 r/min下離心10min。取1 mL上清液, 再加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液,用紫外可見分光光度計(UV-1800, 島津, 日本)測定其在595 nm處的吸光度, 再用標(biāo)準曲線計算SP含量。用牛血清蛋白作為標(biāo)準。

1.5 葉綠素含量測定

通過離心(12000×g, 5min)收集藻細胞, 棄上清液, 加入5 mL 90%的丙酮, 然后在4℃的暗環(huán)境中靜置12h。提取液在20℃, 5000 r/min的條件下離心10min后, 取上清液, 于紫外可見分光光度計(UV-1800, 島津, 日本)上測定各波長下的吸光度。根據(jù)以下公式計算藻細胞的Chl.a,c含量[29]:

Chl.a(μg/mL)=11.47×A664-0.40×A630

Chl.c(μg/mL)=24.36×A630-3.73×A664

式中,A630和A664分別代表在波長630和664 nm下的吸光度。

1.6 碳酸酐酶活性測定

CA活性用調(diào)整后的電量法進行測定[30]。將純水置于4℃恒溫循環(huán)水浴中, 通入高純度CO2氣體約60min, 制取CO2飽和水。將反應(yīng)槽連接在恒溫水浴循環(huán)器上, 使反應(yīng)槽中的溫度維持在4℃。取5 mL含藻細胞(6.0×106cell/mL)的巴比妥溶液(20 mmol/L,pHnbs8.3)置于反應(yīng)槽中, 然后加入4 mL的CO2飽和水(4℃)測定pHnbs8.3降至pHnbs7.3所需的時間。CA活性通過以下公式測定: Units CA=10×(T0/T-1),其中,T0和T分別表示不存在和存在酶的情況下pH從8.3下降到7.3所需的時間。

1.7 Rubisco活性測定

Rubisco活性測定參照Helbling等[31]的方法。離心收集藻細胞后, 將酶粗提取液加入到離心管中,搖勻后將細胞置于4℃的冷水浴中用超聲波進行破碎, 然后在12000×g, 4℃下離心15min, 取上清液。酶粗提的緩沖溶液(pHnbs8.00)包含50.00 mmol/L Tril-HCl、20.00 mmol/L MgCl2、0.20 mmol/L EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)和5.00 mmol/L Glutathione。Rubisco活性測定混合溶液(pHnbs8.00)中包含0.20 mmol/L還原性輔酶Ⅰ(Nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)、3.00 mmol/L ATP (Adenosine triphosphate, ATP)、5.00 mmol/L磷酸肌酸(Phosphatecreatine, CP)、25.00 mmol/L碳酸氫鈉(Sodium Bicarbonate, NaHCO3)、22.00 units磷酸肌酸激酶(Creatine phosphokinase, CPK)、18.00 units 3-磷酸甘油磷酸激酶(3-Phosphoglyceric phosphokinase)和9.00 units甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)。將酶粗提取液加入到Rubisco測定的混合溶液中, 然后用紫外可見分光光度計(UV-1800, 島津, 日本)在20℃下測定NADH在340 nm下吸光度的變化。藻細胞Rubisco活性以mAbs 340/mg protein.s表示。

1.8 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用軟件Excel和Origin 8.51進行數(shù)據(jù)處理與分析, 用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Student'st-test分析不同實驗處理間的差異性。直方圖上不同字母表示在同一光強下不同濃度CO2處理之間的顯著差異, 以P＜0.05為差異顯著水平。數(shù)值表示為平均值± SD,n=3。

2 結(jié)果

2.1 生長

如圖 1所示, 在低光強下, 不同的CO2濃度下培養(yǎng)的三角褐指藻比生長速率并沒有存在顯著的差異(P＞0.05); 而在高光強下, HC條件下培養(yǎng)的三角褐指藻比生長速率比MC和LC條件下培養(yǎng)的分別增加了2.20% (P＜0.05)和3.2% (P＞0.05)。

圖 1 不同光強和CO2濃度對三角褐指藻比生長速率的影響Fig. 1 Effect of light intensity and CO2 concentration on specific growth rate of Phaeodactylum tricornutum

2.2 凈光合速率

在低光強下, 不同濃度CO2下培養(yǎng)的三角褐指藻的凈光合速率并無顯著差異(P＞0.05) (圖 2)。而在高光強下培養(yǎng)的三角褐指藻的凈光合速率隨著CO2濃度的增加而顯著升高(P＜0.05), 在HC下培養(yǎng)的三角褐指藻的凈光合速率分別是在MC和LC下培養(yǎng)的1.37 (P＞0.05)和1.78倍(P＜0.05) (圖 2)。

2.3 葉綠素含量

在低光強下, 不同濃度CO2下培養(yǎng)的三角褐指藻Chl.a和Chl.c含量并無顯著差異(P＞0.05) (圖 3)。在高光強下, LC下培養(yǎng)的Chl.a含量分別是MC和HC下培養(yǎng)的1.38 (P＞0.05)和2.17倍(P＜0.05); LC下培養(yǎng)的Chl.c含量分別是在MC和HC下培養(yǎng)的1.20(P＞0.05)和2.24倍(P＜0.05) (圖 3)。

2.4 可溶性蛋白含量

圖 2 不同光強和CO2濃度對三角褐指藻凈光合速率的影響Fig. 2 Effect of light intensity and CO2 concentration on net photosynthetic rate of Phaeodactylum tricornutum

在低光強下, 不同濃度CO2下培養(yǎng)的三角褐指藻可溶性蛋白含量并無顯著差異(P＞0.05) (圖 4)。而在高光強下, MC和HC下培養(yǎng)的可溶性蛋白含量比在LC下培養(yǎng)的分別下降了20.0% (P＜0.05)和28.8%(P＜0.05) (圖 4)。

2.5 碳酸酐酶活性

如圖 5所示, 無論在高光強或低光強下, 三角褐指藻的胞外碳酸酐酶(eCA)活性均隨CO2濃度升高而降低。在低光強下, MC和HC下培養(yǎng)的細胞其eCA活性分別是LC下培養(yǎng)的59.09% (P＜0.05)和22.73% (P＜0.05)。在高光強下, MC和HC下培養(yǎng)的eCA活性分別是LC下培養(yǎng)的62.71% (P＜0.05)和39.98% (P＜0.05) (圖 5)。

2.6 Rubisco活性

如圖 6所示, 在低光強下, Rubisco活性隨CO2濃度增加而升高, 其均值分別為0.52、0.91和1.27×10-3mAbs/μg(SP).s, 其中在HC下培養(yǎng)的Rubisco活性分別是LC和MC下培養(yǎng)的2.42 (P＜0.05)和1.39倍(P＜0.05)。在高光強下Rubisco活性隨CO2濃度增加而升高, 其均值分別為0.89、1.74和6.0×10-3mAbs/μg(SP).s, 其中HC下培養(yǎng)的Rubisco活性分別是LC和MC下培養(yǎng)的6.72 (P＜0.05)和3.45倍(P＜0.05)。

3 討論

3.1 生長與光合作用

圖 4 不同光強和CO2濃度對三角褐指藻可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effect of light intensity and CO2 concentration on soluble protein content of Phaeodactylum tricornutum

光和CO2濃度是重要的環(huán)境因子, 對于藻類的光合作用和生長有重要的影響。早期的研究表明,高濃度的CO2和光強的增加將有利于促進藻的生長[13,16,32]。本研究結(jié)果表明, 在低光強下, CO2濃度變化對三角褐指藻的凈光合速率和生長并無顯著影響, 而在高光強下, CO2濃度的增加能夠提高凈光合速率和促進三角褐指藻的生長。CO2濃度升高能夠促進藻細胞生長, 往往與藻細胞在高濃度CO2下減少了用于轉(zhuǎn)運的能量輸出并將這部分能量用于促進生長有關(guān)[33]。在低光條件下, 藻細胞獲取光能的量減少, 對無機碳(Inorganic carbon, Ci)的利用能力受到限制[21,34], 使得藻細胞的光合作用達到飽和狀態(tài), 削弱了CO2濃度升高對凈光合速率和生長的影響。因此, 在低光下, CO2濃度的變化對三角褐指藻的凈光合速率和生長并無顯著影響。而在高光和高濃度CO2條件下, 藻細胞能夠獲取更加充足的光能和碳源, 有利于提高凈光合速率。此外,酸化條件下的藻細胞CCM的下調(diào)減少了能量消耗,并將這部分能量用于藻細胞的生長[17,35]。

圖 5 不同光強和CO2濃度對三角褐指藻eCA活性的影響Fig. 5 Effect of light intensity and CO2 concentration on eCA activity of Phaeodactylum tricornutum

Sinutok等[36]的研究結(jié)果顯示, 在光強250 μmol/(m2.s)和海洋酸化條件下Halimeda macroloba和Halimeda cylindracea的葉綠素含量明顯下降, 這與我們的結(jié)果是相似的。在低光強下, 藻細胞通過增加葉綠素含量來提高光的捕獲能力, 為CCM的運行提供更充足的能量[16]; 而在高光下, 藻細胞通過減少色素含量以達到光保護的目的[37]。此外, 在酸化條件下CCMs活性被削弱, 減少了能量的消耗, 促使藻細胞通過減少葉綠素含量來避免過度的光能吸收以達到光保護的目的[34]。葉綠素和SP的合成需要大量的N, 在低光下, ATP的合成減少, 導(dǎo)致藻細胞對N的同化能力受到限制并影響葉綠素和SP的合成,從而削弱CO2濃度對葉綠素和SP含量的影響[38]。而在高光強下, CO2濃度的升高導(dǎo)致三角褐指藻SP的含量減少, 這是由于在酸化條件下, 更多的N被用于藻細胞生長過程中的氮代謝和結(jié)構(gòu)同化[39, 40]。

圖 6 不同光強和CO2濃度對三角褐指藻Rubisco活性的影響Fig. 6 Effect of light intensity and CO2 concentration on Rubisco activity of Phaeodactylum tricornutum

3.2 酶活性

CA和Rubisco是硅藻CCMs和固碳的重要組成部分, CA通過催化CO2和相互轉(zhuǎn)化的可逆反應(yīng)以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的CO2濃度, 而Rubisco是催化CO2進入生物圈的關(guān)鍵酶, 兩者對于藻的光合固碳效率有著極為重要的影響。本研究結(jié)果表明在高、低光強下, CA活性均值隨著Ci濃度的升高而降低, 這與Martin等[41,42]的研究結(jié)果是相一致的。CO2濃度的升高使得通過自由擴散進入藻細胞內(nèi)部的CO2含量增加, 削弱了藻細胞對于eCA的依賴, 導(dǎo)致eCA活性降低。高光強對Rubisco活性是有促進作用的[43], 這是由于一方面, 光照能夠增加Rubisco的表達量[44]; 另一方面, 光強的增加有利于生成更充足的ATP用于Rubisco的活化[45], 從而提高Rubisco活性。Wu等[46]的研究結(jié)果顯示Rubisco活性隨著CO2濃度的升高而增強, 這與我們的結(jié)果是相一致的。在酸化條件下, 藻細胞CCMs下調(diào), 節(jié)省的能量能夠用于Rubisco的活化, 提高Rubisco的活性[17,35,45]。此外, 增加CO2的濃度將提高細胞內(nèi)CO2/O2值和促進Rubisco的羧化作用, 最終使藻細胞的光合效率得到增強[47]。而在低CO2濃度下, 卡爾文循環(huán)相關(guān)酶(包括Rubisco)活性的降低將導(dǎo)致生長所需底物和能量的缺乏, 最終影響藻細胞的增長[46]。在三角褐指藻光合作用過程中, 充足的光能有助于提高CCM的效率, CO2濃度的增加也有利于減少CCM的能量消耗, 提高光合固碳效率。因此,增加光強和提高CO2濃度能夠優(yōu)化硅藻CCM運行過程中的能量分配, 進而提高硅藻的光合固碳效率。