樊曉盼，馬儷珍，劉一鳴，韓 蕓，李瀟瀟，施 煜,*

（1.天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

傳統(tǒng)肉味調(diào)味基料通常是以動物性資源（肉或骨）為原料，經(jīng)熱-壓浸提、酶法水解、美拉德熱反應(yīng)及調(diào)配等工序制備而成，將其應(yīng)用于肉制品中能起到調(diào)味增香的作用，目前市場上的肉味調(diào)味基料大致分為混合型、熱反應(yīng)型和調(diào)理型三大類[1-3]。肉味調(diào)味基料出現(xiàn)后得到迅速發(fā)展，被廣泛用于加香產(chǎn)品中，其品質(zhì)直接影響加香食品的風(fēng)味和品質(zhì)。隨著食品行業(yè)的蓬勃發(fā)展，肉味調(diào)味基料逐漸成為加香產(chǎn)品的競爭焦點[4]，學(xué)者們對肉味調(diào)味基料的研究主要集中于肉類風(fēng)味體系的建立、香氣成分的分離、提取及其功效研究（抗氧化作用、增香作用、乳化作用、穩(wěn)定作用及與蛋白質(zhì)交聯(lián)作用等）[5-6]。齊景凱等[7]對自制牛骨肉味香精清除2,2'-聯(lián)氮雙-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）自由基（ABTS+·）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、·和·OH的活性及其抗氧化性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)牛骨肉味香精對4 種自由基均有清除作用，且在ABTS體系中的抗氧化能力最強(qiáng)。丁小強(qiáng)等[8]發(fā)現(xiàn)，魚蛋白酶解液底物經(jīng)美拉德熱反應(yīng)后，抗氧化能力大大提高，可以作為一種具備優(yōu)良抗氧化性能的食品添加劑。

微生物在代謝過程中會產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[9]，目前，已有一些學(xué)者報道了發(fā)酵型肉味調(diào)味基料的制備工藝。李松耀等[10]利用霉菌孢子和耐鹽酵母的發(fā)酵研究出一種發(fā)酵制備肉味調(diào)味基料的方法，原料肉經(jīng)蒸煮滅菌后接種霉菌孢子，利用霉菌代謝過程中產(chǎn)生的酶對物料進(jìn)行酶解，從而產(chǎn)生特殊的發(fā)酵香氣；向所得固體發(fā)酵物中接種耐鹽酵母進(jìn)行二次發(fā)酵，進(jìn)一步分解物料并加強(qiáng)其香味特征；在此基礎(chǔ)上添加蛋白酶進(jìn)一步酶解，在所得酶解液中添加氨基酸和還原糖等，經(jīng)美拉德反應(yīng)制得發(fā)酵型肉味調(diào)味基料。魏欣等[11]在酶水解和美拉德反應(yīng)的基礎(chǔ)上，研制出利用純種發(fā)酵或半發(fā)酵結(jié)合酶水解和美拉德熱反應(yīng)制備肉味調(diào)味基料的方法，接種發(fā)酵菌對原料肉進(jìn)行發(fā)酵，并選擇合適的因素水平優(yōu)化發(fā)酵條件，制備出的產(chǎn)品肉香四溢。已有研究證明肉味調(diào)味基料用于肉制品中可以起到調(diào)味、增香、抑菌及抗氧化等作用[12-14]，而經(jīng)過發(fā)酵后的調(diào)味基料又具有促進(jìn)發(fā)色的作用[15]，這正是肉制品加工中亞硝酸鹽的作用之一，但目前尚未有學(xué)者進(jìn)行系統(tǒng)研究來證明其替代亞硝酸鹽的可行性。

本研究所用的發(fā)酵牛肉調(diào)味基料（fermented beef flavor，F(xiàn)BF）是以牛骨肉末為原料，經(jīng)熱-壓浸提、酶解、發(fā)酵和美拉德反應(yīng)制備而成，前期檢測發(fā)現(xiàn)FBF本身具有特殊風(fēng)味[16]，將其加入牛肉餅中具有發(fā)色、增香的功能，同時還具有抑菌、抗氧化等作用。在牛肉餅中添加不同比例FBF，以添加NaNO2作為陽性對照組，不添加NaNO2作為陰性對照組，對牛肉餅進(jìn)行感官評價，并測定產(chǎn)品貯藏過程中的理化指標(biāo)（紅度值（a*）、pH值、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值及亞硝酸鹽殘留量），考察FBF在牛肉餅中的應(yīng)用效果，從而評估其替代或部分替代亞硝酸鹽的可行性，為實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨肉末（冷凍牛胴體電鋸分割時留下的肉末，骨肉比3∶7，m/m） 天津掛月食品有限公司；新鮮牛前肩肉、食鹽、白砂糖、玉米淀粉、雞精、花椒粒、大紅椒、黑胡椒粉、桂皮粉、花椒粉、五香粉、丁香粉、鮮味汁、料酒、香油、葵花籽油、鮮姜末、鮮蔥末、雞蛋等 天津市紅旗農(nóng)貿(mào)市場。

風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g）、蛋白酶（1.5 AU/g）丹麥諾維信公司；THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌） 意大利薩科公司；復(fù)合磷酸鹽 青島食宴大廚房食品有限公司；抗壞血酸鈉 鄭州食全食美商貿(mào)有限公司；亞硝酸鈉 廣州馨之味食品配料商城；硫代巴比妥酸、三氯乙酸、三氯甲烷、氯化鉀、鹽酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、對氨基苯磺酸及鹽酸奈乙二胺 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CM-5色差儀 日本Konica Minolta公司；BS 224s電子天平 塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SX-500高溫高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ST40R高速冷凍離心機(jī) 德國Theromo Scientific公司；FA-25勻漿機(jī)上海弗洛克液體機(jī)械制造有限公司；UV-180紫外分光光度計 日本島津公司；Starter 3100酸度計 美國奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FBF的制備

參考本實驗室前期研究[16]制備FBF。

1.3.2 實驗設(shè)計

表 1 實驗分組設(shè)計Table 1 Experimental grouping and design

以牛前肩肉為原料制作牛肉餅，實驗共設(shè)置10 組，具體分組設(shè)計如表1所示。以不添加任何腌制劑為陰性對照（negative control，NC）組，以添加不同比例亞硝酸鹽為陽性對照（positive control，PC）組，以添加不同比例FBF或0.05 g/kg NaNO2與不同比例FBF復(fù)配為實驗組。

按照表1的分組及設(shè)計配制好肉餡，攪拌均勻后于4 ℃條件下腌制12 h，將肉餡放置于模具成型后油煎制成牛肉餅，無菌環(huán)境下冷卻包裝，貯藏于20 ℃條件下。對新鮮產(chǎn)品進(jìn)行感官評定，并在貯藏1、3、5、7 d時測定其a*、pH值、TBARs值和亞硝酸鹽殘留量。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 感官評價

由10 名經(jīng)過專門培訓(xùn)的食品專業(yè)人員組成感官評定小組（男女各5 人）。所有評定人員在進(jìn)行感官評定前要在感官評定區(qū)待1 h以適應(yīng)環(huán)境，在進(jìn)行口感評定時，評價員在對每個樣品進(jìn)行評價前要用清水漱口，以減小樣品之間的相互影響。牛肉餅的感官評定具體評分標(biāo)準(zhǔn)[17]如表2所示。

表 2 牛肉餅感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of beef patties

1.3.3.2 a*測定

將牛肉餅切去表皮后切成長條狀，用保鮮膜包裹1 層，色差儀經(jīng)校正后測定樣品正反兩面的a*，多次測量取平均值[18]。

1.3.3.3 亞硝酸鹽殘留量測定

參照GB/T 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[19]。

1.3.3.4 TBARs值測定

參考John等[20]的方法，并做適當(dāng)修改。取1.00 g絞碎肉樣放入10 mL離心管中，加入5 mL儲備液（含有0.375%硫代巴比妥酸和15%三氯乙酸的0.25 mol/L鹽酸），沸水浴10 min；冷卻后加入1 mL氯仿，放入高速冷凍離心機(jī)中離心，取上清液測定吸光度。

1.3.3.5 pH值測定

參照GB 5009. 237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2003軟件計算各指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用Statistix 8.1軟件中的Turkey test程序?qū)?shù)據(jù)的差異顯著性（P＜0.05）進(jìn)行分析，用Sigmaplot 10.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉餅的感官評價結(jié)果

表 3 10 組牛肉餅的感官評價結(jié)果Table 3 Sensory evaluation of 10 groups of beef patties

由表3可知：NC組牛肉餅的各項感官指標(biāo)評分均明顯低于其他9 組；對比NC組與PC、FBF、PC-FBF組可以看出，牛肉餅的口感、色澤、滋味和氣味4 項評分隨著NaNO2或FBF的添加量的增加而升高，而產(chǎn)品之間的質(zhì)地差異不大，表明NaNO2和FBF用于牛肉餅中均能起到改善色澤、提高風(fēng)味的作用，但對牛肉餅的質(zhì)地?zé)o顯著影響。NC組牛肉餅的色澤分值遠(yuǎn)低于PC組（P＜0.05），這是由于亞硝酸鹽在肉制品中具有發(fā)色作用[22]，因此PC組的牛肉餅色澤鮮艷；FBF組牛肉餅的口感明顯優(yōu)于NC組，說明FBF的添加能夠增強(qiáng)產(chǎn)品風(fēng)味，添加不同比例的FBF為牛肉餅增添了特殊的風(fēng)味，使得牛肉餅口感更加爽口細(xì)膩。與NC組相比，PC-FBF組牛肉餅的口感、色澤、滋味和氣味評分均有明顯提高，其中口感和色澤評分差別最大（P＜0.05），說明亞硝酸鹽和FBF同時發(fā)揮功效，使得牛肉餅的色澤和風(fēng)味都得到明顯增強(qiáng)。對牛肉餅進(jìn)行感官評價的結(jié)果表明，F(xiàn)BF對肉制品具有提色、增香的作用，且NaNO2-FBF復(fù)配使用（PC-FBF組）會使牛肉餅的感官評分更高，添加0.05 g/kg亞硝酸鹽+40 g/kg FBF時效果最佳。

2.2 牛肉餅貯藏過程中a*的變化

表 4 10 組牛肉餅貯藏過程中a*的變化Table 4 Changes in a* during storage of 10 groups of beef patties

由表4可知，貯藏期間NC組牛肉餅的a*顯著低于其余3 組（PC、FBF和PC-FBF組）（P＜0.05），而PC、FBF和PC-FBF 3 組之間無顯著性差異，a*均處于9.20～15.63之間。PC組牛肉餅由于添加了亞硝酸鹽，a*明顯上升，這是由于亞硝酸鹽具有發(fā)色作用，酸性條件下，亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變成亞硝酸，亞硝酸不穩(wěn)定，常溫下分解成亞硝基，亞硝基與肉中的肌紅蛋白和血紅蛋白結(jié)合生成穩(wěn)定的亞硝基肌紅蛋白和亞硝基血紅蛋白，使肉制品呈現(xiàn)鮮艷的紅色[23-25]。添加FBF的牛肉餅a*顯著高于NC組（P＜0.05），略低于PC組，這是由于FBF是以牛骨肉末為原料經(jīng)微生物發(fā)酵制備而成的，乳酸菌、葡萄球菌等在沒有亞硝酸鹽的環(huán)境下，能夠使高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)變成亞硝基肌紅蛋白，起到發(fā)色作用[26-27]。NaNO2-FBF復(fù)配后應(yīng)用于牛肉餅中（PC-FBF組），產(chǎn)品的a*均與PC組差異不顯著，說明添加FBF能夠起到與NaNO2相當(dāng)?shù)陌l(fā)色效果。

2.3 牛肉餅貯藏過程中pH值的變化

表 5 10 組牛肉餅貯藏過程中pH值的變化Table 5 Changes in pH value during storage of 10 groups of beef patties

由表5可知，10 組牛肉餅貯藏過程中的pH值變化不大，處于6.06～6.48之間。隨著貯藏時間的延長，牛肉餅的pH值整體呈上升趨勢，這是由于隨著貯藏時間的延長，肌肉蛋白會在微生物代謝物和內(nèi)源酶的作用下降解為多肽和氨基酸，釋放堿性基團(tuán)，使pH值升高。本實驗室前期研究FBF時發(fā)現(xiàn)，在牛肉餅中添加FBF超過50 g/kg時，會導(dǎo)致pH值降低，低pH值則會加劇蛋白質(zhì)的變性，使產(chǎn)品口感粗糙[28]。本研究中FBF的添加量在20～40 g/kg之間，根據(jù)pH值測定結(jié)果分析得知，在貯藏期內(nèi)，添加40 g/kg FBF的牛肉餅pH值變化幅度最小，是牛肉餅加工中較合適的腌制劑添加量。

2.4 牛肉餅貯藏過程中TBARs值的變化

TBARs值是評價肉制品脂肪氧化程度的一個重要指標(biāo)，TBARs值與脂肪氧化程度呈正相關(guān)，脂肪氧化會產(chǎn)生酸、醛、酮等物質(zhì)，加劇酸敗程度，脂肪氧化程度增加還會產(chǎn)生自由基，破壞肉制品中的色素，從而導(dǎo)致肉制品品質(zhì)下降[29-30]。

表 6 10 組牛肉餅貯藏過程中TBARs值的變化Table 6 Changes in TBARs value during storage of 10 groups of beef patties mg/kg

由表6可知，10 組牛肉餅的TBARs值隨著貯藏時間的延長整體呈上升趨勢。PC組牛肉餅的TBARs值始終較低，這是由于亞硝酸鹽具有抗氧化性；FBF組牛肉餅的TBARs值雖高于PC組，但始終低于NC組，說明本研究添加的FBF也具有一定的抗氧化性。此外，并非FBF的添加量越高，其抗氧化能力越強(qiáng)，F(xiàn)BFH組的TBARs值有時反而高于FBFM組，這可能是由于FBF本身含有一定量的脂肪（2%），在牛肉餅貯藏過程中，F(xiàn)BF自身的脂肪發(fā)生氧化，使得TBARs值增大。在接下來的研究中，可以考慮將FBF中的脂肪去除，避免其自身氧化導(dǎo)致的產(chǎn)品變質(zhì)。

2.5 牛肉餅貯藏過程中亞硝酸鹽殘留量的變化

由表7可知，牛肉餅貯藏過程中的亞硝酸鹽殘留量呈下降趨勢，說明亞硝酸鹽被用于促進(jìn)牛肉餅發(fā)色、抑菌及抗氧化等過程。PC組和PC-FBF組牛肉餅貯藏0～3 d的亞硝酸鹽殘留量始終高于國家限定標(biāo)準(zhǔn)（30 mg/kg），說明產(chǎn)品貯藏初期，亞硝酸鹽尚未完全發(fā)揮作用，直到第5天時，低劑量的亞硝酸鹽組（PC1組）和PC-FBF組才達(dá)標(biāo)，這就大大降低了產(chǎn)品的安全性。FBF組牛肉餅的亞硝酸鹽殘留量在貯藏第1天時為23.98～35.76 mg/kg，且之后始終低于PC組；貯藏第7天時，F(xiàn)BF組牛肉餅中的亞硝酸鹽殘留量為2.71～3.72 mg/kg，接近NC組（2.45 mg/kg），遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PC組。僅添加亞硝酸鹽的牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量的下降趨勢較緩慢，而同時添加亞硝酸鹽和FBF的牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量在第5天呈急劇下降趨勢，說明FBF會促進(jìn)亞硝酸鹽發(fā)揮功效，從而避免牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量超標(biāo)。從牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量這一指標(biāo)分析，只添加FBF的牛肉餅中亞硝酸鹽殘留量最低，不同F(xiàn)BF添加量的作用效果差異不明顯。

表 7 10 組牛肉餅貯藏過程中亞硝酸鹽殘留量的變化Table 7 Changes in nitrite residue during storage of 10 groups of beef patties mg/kg

3 結(jié) 論

不同添加量的FBF及FBF-NaNO2復(fù)配對牛肉餅的色澤、風(fēng)味、脂肪氧化程度和亞硝酸鹽殘留量均有一定影響。FBF的添加能顯著增強(qiáng)牛肉餅的風(fēng)味，添加量越大，風(fēng)味評分越高；不同比例FBF復(fù)配0.05 g/kg NaNO2均比單獨添加0.05 g/kg NaNO2制成的牛肉餅風(fēng)味評分高；添加FBF可起到發(fā)色的作用，且發(fā)色效果能夠達(dá)到與添加0.10 g/kg亞硝酸鹽相當(dāng)?shù)乃?；與亞硝酸鹽相比，只添加FBF的產(chǎn)品亞硝酸鹽殘留量低，產(chǎn)品安全性較高。綜合考慮各組產(chǎn)品的色澤、口感、抗氧化效果及亞硝酸鹽殘留情況，將20 g/kg FBF和0.05 g/kg NaNO2復(fù)配后添加到牛肉餅中進(jìn)行加工，制得的產(chǎn)品色澤誘人、風(fēng)味獨特且安全性較高，將其應(yīng)用于肉制品中替代部分亞硝酸鹽具有廣闊的市場前景。