董曉斐，丁小玉，賀佳幸，屈 波

（1．湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2．湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410208）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)病機制尚未闡明，目前研究表明有很多誘發(fā)因素與之相關，國內(nèi)外公認與血脂代謝紊亂有關，尤其是高脂血癥的存在[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)：Wnt信號通路與動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)病密切相關[2]，可能成為控制動脈粥樣硬化的新型靶點。TOLL樣受體4（TOLL-like receptor 4，TLR4）激活可以介導AS血管壁炎癥，抑制TLR4是否會影響Wnt信號的表達，目前尚未見報道。既往研究表明，護心康對AS的防治具有較好的療效，本研究通過TLR4-/-小鼠AS模型，觀察Wnt信號通路中β-catenin的變化及護心康的干預作用，探討護心康防治AS的作用機制，為AS的治療及臨床用藥提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

S P F級T L R 4基因敲除小鼠7 0只，6周齡，（20.3±2.5）g，雄性，購自南京大學模式動物研究所，合格證號：201800971.普通飼料由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，高脂飼料由上海普路騰生物科技有限公司生產(chǎn)提供，動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室。實驗過程中，所有研究人員均人道地進行動物實驗，嚴格遵守動物實驗的各項倫理條例。

1.2 藥物

阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格20 mg/片，國藥準字國藥準字H20051408）。護心康片（湖南省中醫(yī)研究院附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號為（湘）衛(wèi)藥劑（2003）12第039號），由瓜蔞皮、薤白、陳皮、遠志、法半夏、茯苓、蓽澄茄、石菖蒲、旋覆花、隔山消、苦杏仁、茜草、三七、丹參、蒲黃、五靈脂、琥珀、北山楂、葳蕤、黃芪、炙甘草等組成，每片含生藥0.3 g。

1.3 主要試劑與儀器

膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯檢測試劑盒及檢測儀器cobas8000全自動生化分析儀由羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司提供；β-catenin兔抗小鼠單克隆抗體、PV-6002羊抗小鼠IgG/HRP聚合物由美國GBI公司提供；WIF由美國R&D公司提供；Olympus BX-51光學顯微鏡及數(shù)碼攝影系統(tǒng)由日本奧林帕斯公司生產(chǎn)。

1.4 模型建立及處理

SPF級TLR4-/-小鼠共70只，雌雄各半，隨機取12只為正常對照組，予以普通飼料喂養(yǎng)；其余58只予以高脂飼料喂養(yǎng)13周，飼料含脂肪21%，膽固醇0.15%[3]。13周后隨機抽取5只解剖觀察胸主動脈，光鏡下發(fā)現(xiàn)斑塊為造模成功；造模過程中死亡5只小鼠。造模成功的動物隨機分為模型組、護心康組、阿托伐他汀組、Wnt抑制劑WIF組，每組12只，分別予以相應處理。正常組不做處理，其余各組均予灌胃和腹腔注射處理，灌胃容積均為0.5 mL、腹腔注射容積均為0.3 mL，1次/d。模型組予以生理鹽水灌胃并腹腔注射；護心康組按動物與人體間的等效換算法，按生藥劑量21.6 g/kg·d灌胃，腹腔注射生理鹽水；阿托伐他汀組按3 mg/（kg·d）灌胃，腹腔注射生理鹽水；Wnt抑制劑WIF用量為2 ug，生理鹽水稀釋后腹腔注射，生理鹽水灌胃，上述處理時間均為8周。

1.5 觀察指標

于第21周末，3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，進行心臟采血，使用酶比色法檢測血脂，按照試劑盒說明書進行操作。然后打開小鼠胸廓充分顯露心臟，將主動脈分離出來，取胸主動脈固定于4%的多聚甲醛中，取小鼠主動脈血管，乙醇脫水及二甲苯透明后石蠟包埋切片，常規(guī)脫臘脫水后進行HE染色，光鏡下進行病理學觀察。免疫組織化學法測定β-cateninn，以標本出現(xiàn)棕黃色為陽性顯色；OlympusBX-51光學顯微鏡400 倍觀察切片，應用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行光密度分析，每張切片分析5個連續(xù)的視野， 取其均值為該標本測量結果。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD和Dunnet檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 血脂檢測

造模后動物的血脂水平比正常組明顯升高（P＜0.05），其中高密度脂蛋白的升高考慮是機體受到膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的刺激后產(chǎn)生的應激性增高，屬于保護性；阿托伐他汀和護心康對膽固醇和低密度脂蛋白的升高具有明顯的療效（P＜0.05），WIF的對其的降低作用不明顯；三種藥物對甘油三酯和高密度脂蛋白的影響相對較小，見表1。

表1 各組血脂檢測（±s，mmol/l）

表1 各組血脂檢測（±s，mmol/l）

注： 與正常組相比aP＜0.05，與模型組相比bP＜0.05；與他汀組相比cP＜0.05

組別 n 膽固醇 甘油三酯 低密度脂蛋白 高密度脂蛋白正常組 12 1.85±0.23 1.21±0.25 0.45±0.37 1.42±0.35模型組 12 3.21±0.50a 2.52±0.45a 0.92±0.26a 2.64±0.41a阿托伐他汀組 12 1.83±0.37b 1.68±0.40 0.36±0.19b 1.80±0.34 WIF組 12 2.97±0.28c 1.74±0.25 0.73±0.20a 1.96±0.23護心康組 12 2.01±0.36b 1.81±0.52 0.43±0.28b 1.83±0.29

2.2 病理學觀察

造模過程中小鼠死亡5只。21周后觀察光鏡胸主動脈。正常組無斑塊形成，主動脈管壁分層清楚，內(nèi)膜平整光滑，內(nèi)皮細胞排列整齊，平滑肌細胞走形良好。模型組動脈內(nèi)膜明顯增厚，大量斑塊形成，血管腔明顯減小，表明造模成功。各藥物干預組亦內(nèi)膜均有不同程度增厚，伴有粥樣斑塊形成，但斑塊病變減輕，斑塊面積變小，泡沫細胞減少，見圖1。

2.3 β-catenin蛋白的表達

細胞胞漿可見的棕黃色顆粒為β-catenin蛋白的陽性表達，棕黃色顆粒越多，表達越明顯。高脂造模后，模型組中β-catenin蛋白表達明顯高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，三種藥物均能降低β-catenin ，Wnt抑制劑WIF降低作用較強（P＜0.01），護心康組和阿托伐他汀組也有明顯的降低作用（P＜0.05）；WIF降低β-catenin的作用較阿托伐他汀強（P＜0.05），圖2、表2。

圖1 各組病理學改變（HE染色，×100）

圖2 各組β-catenin的表達（HE染色，×400）

表2 免疫組化檢測β-catenin蛋白表達（±s）

表2 免疫組化檢測β-catenin蛋白表達（±s）

注： 與正常組相比aP＜0.01；與模型組相比bP＜0.05；cP＜0.01；與阿托伐他汀組相比dP＜0.05

組別 n β-catenin正常組 12 15.13±4.54模型組 12 40.27±5.16a阿托伐他汀組 12 35.52±4.60ab WIF組 12 31.30±5.63abcd護心康組 12 36.67±4.71ab

3 討 論

實驗和臨床研究表明，動脈粥樣硬化的發(fā)生與高血脂有密切關系，高血脂可以導致血管內(nèi)皮細胞功能障礙，脂質(zhì)沉積，同時誘發(fā)單核細胞浸潤血管壁，，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞，誘發(fā)慢性血管炎癥，導致血管壁增厚，管腔狹窄。Wnt是由19個蛋白分子構成的分泌蛋白家族，通過分泌蛋白與細胞膜上的受體結合，激活相應的基因表達，從而影響細胞粘附和炎癥因子的釋放等生理病理過程。Wnt信號通路分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩大類，Wnt/β-catenin信號通路屬于經(jīng)典型通路，居于Wnt通路中研究之首。Wnt與其受體卷曲蛋白或低密度脂蛋白受體相關蛋白結合，通過一系列反應，導致細胞內(nèi)β-catenin增多，進而與T細胞因子/淋巴細胞增強因子發(fā)生相互作用，激活Wnt信號通路相關靶基因，從而影響下游炎癥反應和細胞粘附[4]。β-catenin蛋白屬于Wnt /β-catenin 通路的上游因子，表達于內(nèi)皮細胞中。研究表明：動脈粥樣硬化斑塊中β-catenin的基因和蛋白表達明顯升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路參與了AS的形成[5]。激活血管內(nèi)皮細胞的Wnt/β-catenin信號通路，可以導致內(nèi)皮功能障礙，單核細胞對內(nèi)皮細胞的黏附性增強，使單核細胞易于和內(nèi)皮粘附，從而誘發(fā)血管壁炎癥[6]。β-catenin也可激活Wnt/β-catenin通路，進而導致促炎細胞因子的表達釋放，表明Wnt/β-catenin通路在炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用[7]。激活Wnt信號通路可導致脂代謝紊亂，損傷內(nèi)皮細胞，說明其與高血脂有密切關系[8]。以上研究都提示：Wnt信號通路與動脈粥樣硬化形成的多個環(huán)節(jié)有關，尤其是高血脂和炎癥反應有關，主要作用靶點為內(nèi)皮細胞和單核細胞。

中醫(yī)學認為，動脈粥樣硬化的主要病理基礎是痰濁和瘀血，因此治療中常常貫徹活血化瘀和祛痰消濁。護心康主要具有消痰散結和活血行瘀的作用，在臨床冠心病的治療中取得了較好的療效。研究發(fā)現(xiàn)：護心康對痰瘀阻絡型冠心病具有較好的療效，能有效改善心絞痛的發(fā)作癥狀和心電圖表現(xiàn)[9]；同時提高患者的生存質(zhì)量[10]。護心康可以降低冠心病患者血清超敏C反應蛋白和sICAM-1水平[11]，血清超敏C反應蛋白是判斷炎癥的靈敏指標，其表達下降可以降低單核細胞分泌炎癥因子；血清sICAM-1含量降低可以減少炎癥反應導致的細胞黏附，護心康通過降低二者的表達，減輕炎癥反應，延緩冠心病的發(fā)生發(fā)展。

我們前期以兔動脈粥樣硬化為模型的實驗中，發(fā)現(xiàn)護心康能有效降低血脂[12]，抑制動脈粥樣硬化斑塊中TLR4、TNF-α的表達[13-14]，并抑制內(nèi)皮細胞MyD88 和TRAF6基因的表達[15]，這些作用共同合力可以起到延緩血管壁炎癥的作用。敲除TLR4基因?qū)用}粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有和影響呢？本實驗研究顯示：高脂飼料喂養(yǎng)的TLR4-/-小鼠，血脂水平明顯升高；光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增厚，動脈粥樣硬化斑塊形成，血管腔狹窄；說明單純抑制TLR4并不能杜絕高脂誘發(fā)的動脈粥樣硬化發(fā)生，即動脈粥樣硬化是由多因素共同作用而成，單一靶點的處理很難起到一錘定音的效果。免疫組化測定模型組中β-catenin的表達水平較正常組明顯增高，進一步證實動脈粥樣硬化與Wnt信號通路存在緊密聯(lián)系。分別采用降血脂藥物阿托伐他汀、Wnt抑制劑WIF及中藥復方護心康對AS模型進行干預，結果顯示三種藥物均能抑制β-catenin，其中Wnt抑制劑組降低β-catenin的作用較阿托伐他汀和護心康強，其中護心康和阿伐他汀可以明顯降低血膽固醇和低密度脂蛋白。我們推測，護心康可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，減弱下游的炎癥反應，從而起到抑制動脈粥樣硬化的作用。