黃景文 李生強 陳娟 謝麗華 陳玄 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥研究院骨質(zhì)疏松證候基因組學研究室，福建 福州 350001

人口老齡化帶來的骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)及其導致的骨折成為了人類需要面對的新問題，其顯著的發(fā)病率和引起的死亡率嚴重影響著中老年人的健康[1]。 骨質(zhì)疏松會導致限制性肺病、駝背、腹脹和身高降低。常見骨折的部位為髖部、椎骨和腕部[2]。其中與較高死亡率相關的是髖部骨折，大部分患者會在骨折發(fā)生后的3～6個月內(nèi)死亡。多數(shù)幸存患者在他們今后的日常生活中將面臨巨大困難。盡管近年來對于骨質(zhì)疏松癥的診治技術不斷提高，其效果仍較差，減少骨質(zhì)疏松癥導致的骨折及預防其發(fā)生仍是關鍵[3]。中醫(yī)認為， “腎”與骨存在著密切的內(nèi)部聯(lián)系，即所謂的“腎藏精，精生髓、髓藏于骨中，滋養(yǎng)骨骼”。腎精不足，則致精不充髓，髓無以養(yǎng)，故骨軟不堅。強調(diào)骨的功能是否正常與腎的精氣盛衰密切相關，并且隨著年齡增長，腎精逐漸虧虛，髓虧骨萎，則發(fā)生骨質(zhì)疏松，且逐漸加重[4]。通過網(wǎng)絡藥理學手段，獲得治療骨質(zhì)疏松癥中藥復方的活性成分，識別復方中藥物作用靶點，構建相關基因網(wǎng)絡， 確定調(diào)控的重要信號通路及子網(wǎng)絡，分析和處理骨質(zhì)疏松癥相關的作用機制，從而方便實驗人員查詢骨質(zhì)疏松的最新數(shù)據(jù)，研究探討骨質(zhì)疏松癥調(diào)控的分子網(wǎng)絡，將為骨質(zhì)疏松的治療和預防提供新的途徑。

1 網(wǎng)絡藥理學的概念

以往的藥物研發(fā)遵循“一個藥物、一個基因、一種疾病”的模式，然而許多有效的藥物成分是通過調(diào)節(jié)多個基因而不是單一目標，這就是為什么70%的新藥會在臨床試驗失敗的主要原因。網(wǎng)絡藥理學[5]是隨著發(fā)現(xiàn)多靶點藥物理念的興起，基于系統(tǒng)生物學的理論，對疾病網(wǎng)絡多靶點進行綜合分析的新學科，它的發(fā)展已逐漸成為一個熱門的研究模式。融合了多向藥理學思想和系統(tǒng)生物學的網(wǎng)絡藥理學，將疾病與藥物利用網(wǎng)絡結合起來，通過分析網(wǎng)絡間模塊的關系，進行全面的網(wǎng)絡分析，研究中藥復方的作用機制，通過新方法來獲得新數(shù)據(jù)和新成果[6]。

網(wǎng)絡藥理學研究中藥復方主要可分為四個部分：① 獲取中藥復方的活性成分。這部分可通過數(shù)據(jù)庫獲得；② 獲得活性成分的可能作用靶點。當前獲取活性成分作用靶點的途徑主要是計算預測和數(shù)據(jù)庫查詢法。計算預測法是利用計算機對活性成分的三維空間結構的模擬計算，與已知結構的靶點數(shù)據(jù)庫進行對接，查找可能結合的結構相似的化合物或者生物大分子，以此來預測中藥復方潛在的靶點，當前常用的預測方法是反向分子對接[7]和化學相似性搜索[8]等方法。數(shù)據(jù)庫查詢法主要是基于前期大量實驗和計算所得出的靶標信息開發(fā)得到的靶標數(shù)據(jù)庫，如Drugbank[9]、TTD、STITCH[10]、PDTD[11]等，通過查詢這些數(shù)據(jù)庫，可以獲得所想要的靶點信息；③ 疾病相關基因的獲取和網(wǎng)絡構建。獲取疾病相關基因可通過數(shù)據(jù)庫查詢或者文獻挖掘獲取，數(shù)據(jù)庫如OMIM[12]、GAD(genetic association database)[13]、GeneCard[14]等。疾病網(wǎng)絡構建可以將獲取的疾病相關基因與背景網(wǎng)絡結合起來，得到這些基因間的全部相互作用，通過最近鄰居法[15]、最短路徑法[16]等算法預測藥物可能影響的相關基因，之后對病理機制深入分析；④ 藥物調(diào)控的信號通路和靶標蛋白間的相互作用評價。蛋白富集信號通路的識別可以通過現(xiàn)有的信號通路數(shù)據(jù)庫KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)[17]、Biocarta等將藥物靶標蛋白映射到信號通路中，靶標蛋白顯著富集的通路則是藥物調(diào)控的可能通路。藥物靶標間的蛋白相互作用的分析能夠確定藥物對疾病網(wǎng)絡的影響，但靶標蛋白在全基因組的背景網(wǎng)絡下并不是都能在一起，因此可以通過啟發(fā)式算法[18]、Steiner最小生成樹算法[19]、網(wǎng)絡鄰近度打分算法[20]等來將藥物作用的靶標蛋白相互作用聯(lián)系起來，這樣有利于對其治療效果進行評價，從多方面了解中藥復方的作用方式。

2 傳統(tǒng)中藥研究與網(wǎng)絡藥理學

傳統(tǒng)中藥歷史悠久，在治療復雜病癥方面因其溫和的治療效果和較低的副作用引起了廣泛的關注。在西方，越來越多的人認識到，以多種化合物和多種生物目標為特征的中藥比單一的藥物治療更加有效，特別是治療復雜的慢性疾病，如精神分裂癥、抑郁癥和糖尿病等[21]。盡管中醫(yī)有經(jīng)驗，但是缺乏適當?shù)姆椒▉硖剿魈囟ú菟幍木唧w成分，對了解疾病的機制有著不小的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)藥理學認為缺乏對藥物機制的理解意味著無法預測藥物的不良影響，從而阻礙了中藥醫(yī)學的全球化和現(xiàn)代化[22]。

科學家在基于生物信息學研究中醫(yī)藥藥理的方面進行了大量的研究，構建了多種中藥數(shù)據(jù)庫。TCM[23]數(shù)據(jù)庫、3D-MSDT[24]、TCMID[25]和TCMDatabase@Taiwan數(shù)據(jù)庫等，這些數(shù)據(jù)庫都收錄了大量中藥及其主要的化學結構。數(shù)據(jù)庫都是基于系統(tǒng)生物學理論，利用靶點預測和網(wǎng)絡路徑來分析解決中藥的復雜性問題[26]。Wang等[27]利用TCMSP系統(tǒng)獲得治療心血管疾病中藥的18個活性成分，通過ADME系統(tǒng)檢測，結果發(fā)現(xiàn)中藥的18個活性成分與218個治療靶點能發(fā)生相互作用，從而構建藥物和靶點之間的網(wǎng)絡模塊，通過模塊GO通路富集分析(gene ontology analysis)和KEGG通路分析可以得到這些活性成分與炎癥的發(fā)生、心血管萎縮以及血管生成的相關通路有著密切的關系，是一種藥物靶點-信號通路-器官聯(lián)合治療疾病的新型治療模式。

全面分析破譯中藥配方的化合物，了解中藥的分子機制在研究中藥中是必不可少的。Liang等[32]采用一種新的方法來理解六味地黃丸配方的機制，是對于傳統(tǒng)中藥的一種新應用。研究人員通過TCM Database@Taiwan[28]數(shù)據(jù)庫獲得六味地黃丸六味中草藥中的311種化合物，在PubChem上進行物化特性計算[29]，計算包括分子質(zhì)量MW、脂水分配系數(shù)ALogP、氫鍵數(shù)量HBDs、分子極曲面面積PSA、可旋轉鍵的數(shù)量ROTBs以及芳香族的數(shù)量AROMs等在內(nèi)的數(shù)據(jù)，并與已批準使用的771種藥物[30]進行對比，結果發(fā)現(xiàn)被批準使用的藥物分布緊湊，六味地黃丸分布廣并且與被批準藥物間有很大的重疊，表明六味地黃丸中許多成分具有藥物潛力。再使用藥物相似性方法評估311個化合物中能成為藥物的概率，篩選出適合的化合物進行CIPHER預測可能作用疾病的靶點，結果篩選出128個作用靶點。最后將篩選出的化合物和作用靶點構建成網(wǎng)絡，進行GO通路富集分析[31]這些化合物所涉及的疾病及通路。

3 網(wǎng)絡藥理學在骨質(zhì)疏松癥中的應用

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨疾病，其特征為骨質(zhì)量減少、骨骼的微觀結構損傷、骨骼脆性增加和骨折風險增加。在一定程度上骨質(zhì)疏松癥影響了30%的女性和12%的男性，是全世界主要生活質(zhì)量的問題，其防治研究已成為現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點之一[33]。目前迫切需要找到一個好的骨質(zhì)疏松標志物，因此通過網(wǎng)絡藥理學分析得到治療靶點是非常必要的。

近年來有關骨質(zhì)疏松癥標志物的文獻報道較多，在治療和防治骨質(zhì)疏松癥中有著重要的意義。利用網(wǎng)絡藥理學方法不僅可高效進行蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的分析，還可對所有基因產(chǎn)物進行全面的功能分析。在網(wǎng)絡藥理學發(fā)展的基礎上，目前已累積了大量的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，在解讀蛋白質(zhì)分子的作用方面具有重要意義。

3.1 尋找調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成的平衡蛋白

Liu等[35]從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫中獲得多個不同的骨質(zhì)疏松表達譜數(shù)據(jù)，通過KEGG[34]、維恩圖解(venn diagram analysis)和基因功能相互作用網(wǎng)絡共同進行研究。在不同表達蛋白中發(fā)現(xiàn)Rho蛋白可以通過控制骨細胞來調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成的平衡，溶酶體的途徑、有絲分裂中期和后期以及Rho蛋白發(fā)出的信號可能被視為治療骨質(zhì)疏松的治療靶點，這些結論需要進一步的研究來驗證。

3.2 識別治療骨質(zhì)疏松的小分子

Yu等[36]運用經(jīng)典的t-test方法處理多個不同的骨質(zhì)疏松表達譜數(shù)據(jù)，對表達不同的基因進行GO富集分析，確定異常調(diào)節(jié)的基因和不正常的信號通路，并通過CMap連接圖來識別出一些潛在治療骨質(zhì)疏松的小分子。結果表明，在骨質(zhì)疏松和對照組中有5 581個基因發(fā)生了變化，發(fā)現(xiàn)這些基因集中在9個信號通路中，主要包括粘附斑信號通路、MAPK信號通路和RANK/RANKL/OPG信號通路。通過小分子識別，發(fā)現(xiàn)小分子血根堿可能作為未來治療骨質(zhì)疏松的新方法，然而這需要進一步的研究來予以證實。

3.3 發(fā)現(xiàn)相關信號通路中的轉錄因子

Zhu等[37]通過分析卵巢切除小鼠與假手術組的骨質(zhì)疏松表達譜數(shù)據(jù)，對不同表達的基因進行GO富集分析和KEGG通路分析進行鑒定，運用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析(PPI)對蛋白質(zhì)相互作用、PPI模塊、轉錄因子和化學物質(zhì)進行網(wǎng)絡分析。對兩組進行比較后發(fā)現(xiàn)，有784個基因表達上調(diào)，729個基因表達下調(diào)，此外確定了2個上調(diào)的模塊和6個下調(diào)模塊;模塊中上調(diào)的基因主要集中在嗅覺功能和嗅覺轉導通路上，發(fā)現(xiàn)部分基因?qū)儆谛嵊X受體家族;模塊中下調(diào)的基因主要集中在DNA復制起始功能和細胞周期通路中;發(fā)現(xiàn)的8個轉錄因子中，SP1和ETS-1與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有關;化學物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)雌二醇(estradiol)和白藜蘆醇(resveratrol)是相互作用于網(wǎng)絡中的關鍵化學物質(zhì);推測嗅覺作用、細胞復制起始通路、嗅覺轉導通路和細胞周期路徑可能在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮作用。此外基于網(wǎng)絡相互分析，可以考慮使用雌二醇和白藜蘆醇進行絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療。

3.4 在膜蛋白中發(fā)現(xiàn)與骨質(zhì)疏松相關途徑密切相關的蛋白

Zeng等[38]使用定量無標記蛋白組學方法和多個網(wǎng)絡藥理學方法對骨質(zhì)疏松患者的蛋白進行基因富集分析、功能注釋、途徑和網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)有1 070個膜蛋白發(fā)生變化。通過比較這些蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)36種不同的蛋白質(zhì)在骨密度高低間有不用的表達。經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)P4HB、ITGB1、CD36和ACTN1與骨質(zhì)疏松相關途徑密切相關，包括受體相互作用、鈣離子結合、白細胞轉移和白細胞索鈣水平降低。證明了P4HB、ITGB1、CD36和ACTN1對骨質(zhì)疏松病因有著重要的影響。

3.5 對于查找中藥治療骨質(zhì)疏松靶點有著預測作用

梁學振等[39]利用網(wǎng)絡藥理學對中藥補腎活血膠囊進行了查找靶點的研究，利用中藥數(shù)據(jù)庫TCMSP查找出補腎活血膠囊中中藥成分1 186個及入血活性成分249個，發(fā)現(xiàn)可作用的預測靶點145個。接著通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取基因芯片數(shù)據(jù)篩選出124個差異基因，同時檢索疾病相關數(shù)據(jù)庫獲取已知與骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展相關的靶點基因356個。通過網(wǎng)絡藥理學分析骨質(zhì)疏松靶點基因和補腎活血膠囊預測靶點，發(fā)現(xiàn)226個關鍵基因。通過GO分析等篩選出關鍵基因涉及的信號通路，如Wnt信號通路、TGF-β信號通路、Notch信號通路、P13 K-AKT信號通路、VEGF信號通路和甲狀腺素信號通路等，這些通路與骨重建、調(diào)節(jié)成骨破骨代謝平衡、骨微環(huán)境等作用相關，這些實驗結果為未來深入研究補腎活血膠囊治療骨質(zhì)疏松疾病的作用機制奠定了基礎。

4 結語

21世紀是生命科學大發(fā)展的時代，隨著計算機技術和信息論方法的不斷進步，網(wǎng)絡藥理學影響的范圍越來越廣，作為一門新型學科，發(fā)揮著其特殊的橋梁作用和整合作用。在中藥治療骨質(zhì)疏松的研究中，網(wǎng)絡藥理學不僅可以通過計算發(fā)現(xiàn)新基因以及確定新的中藥藥物靶點，還可以進行創(chuàng)新中藥的研究。新基因的發(fā)現(xiàn)可以讓研究者們更有效地了解骨質(zhì)疏松的分子機制，新靶點的發(fā)現(xiàn)與確立能幫助人們在藥物研發(fā)中更早、更快地找到最佳作用靶點，減少研發(fā)時間。創(chuàng)新藥物的研究具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益，隨著網(wǎng)絡藥理學的興起出現(xiàn)了更多的新理論和新思路。運用網(wǎng)絡藥理學研究方法處理生物信息學實驗數(shù)據(jù)、發(fā)現(xiàn)與疾病密切相關的基因或基因群、進行后續(xù)研究驗證，是一種新型的、高效的研究途徑。網(wǎng)絡藥理學現(xiàn)已普遍運用于醫(yī)學的各個研究思路中，對于疾病基因的發(fā)現(xiàn)、新藥物作用靶點的發(fā)現(xiàn)、新型藥物的設計以及基因芯片的設計與芯片數(shù)據(jù)處理等方面起著重要作用。在骨質(zhì)疏松癥治療中促進了對于新的骨質(zhì)疏松標志物的發(fā)現(xiàn)，極大提高了對于骨質(zhì)疏松的診斷和防治水平。