程謙 吳疆 王岱

(廈門大學(xué)分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361102)

革蘭陰性菌細(xì)胞膜包含大量的蛋白質(zhì)，有著重要功能，如營(yíng)養(yǎng)獲取、黏附、分泌、信號(hào)傳遞和應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力等，細(xì)胞膜的破壞對(duì)于細(xì)菌來說是致命的。為了適應(yīng)環(huán)境，革蘭陰性菌進(jìn)化出了一種在不破壞細(xì)胞膜情況下也能分泌出來的來源于細(xì)胞膜的球狀小泡，其中含有DNA、RNA、周質(zhì)蛋白、毒力因子，病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和其他外膜成分。由于其通常來源于細(xì)菌外膜，故又稱為細(xì)菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)[1-2]。細(xì)菌外膜囊泡既不同于傳統(tǒng)的分泌系統(tǒng)，也不同于細(xì)胞裂解及凋亡的產(chǎn)物。越來越多的研究者開始將細(xì)菌外膜囊泡視為一種新的分泌系統(tǒng)，認(rèn)為其能介導(dǎo)細(xì)菌中蛋白質(zhì)、磷脂和核酸等生物大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致毒力和致病能力的提高、影響宿主的生理病理過程[2]。病原微生物與感染性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，目前抗生素依然是感染性疾病治療的主要手段。有研究表明抗生素可以影響細(xì)菌外膜囊泡的合成及分泌，反過來外膜囊泡對(duì)細(xì)菌在抗生素環(huán)境下的存活、耐藥性的獲得等也有作用。但是國(guó)內(nèi)關(guān)于此方面的報(bào)道不多。故本文從細(xì)菌外膜囊泡與抗生素的角度出發(fā)，對(duì)細(xì)菌外膜囊泡這種新的分泌系統(tǒng)、抗生素對(duì)細(xì)菌外膜囊泡影響及細(xì)菌外膜囊泡應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述，以期對(duì)后續(xù)研究提供幫助。

1 細(xì)菌外膜囊泡

病原微生物嚴(yán)重威脅人類健康，一部分原因在于原核生物進(jìn)化出了各種各樣巧妙的分泌途徑來幫助其完成感染及致病。除了經(jīng)典的一型到六型分泌系統(tǒng)，細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中能夠不斷地從外膜上產(chǎn)生直徑在20～250nm的外膜囊泡[3]。細(xì)菌外膜囊泡是一種新型分泌系統(tǒng)的觀點(diǎn)得到了越來越多的認(rèn)同。細(xì)菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是一種直徑為20～250nm，可通過巨胞飲、小窩蛋白、網(wǎng)格蛋白和脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用運(yùn)輸至宿主胞內(nèi)或者胞外特定部位進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用的活性物質(zhì)[4]。囊泡運(yùn)輸途徑相較于其他分泌系統(tǒng)有許多優(yōu)點(diǎn)：它們可以裝載各種類型的物質(zhì)，從蛋白類大分子毒素到疏水性小分子；對(duì)囊泡內(nèi)裝載物有一定保護(hù)作用；并且囊泡運(yùn)輸途徑可以實(shí)現(xiàn)其他分泌系統(tǒng)難以做到的長(zhǎng)距運(yùn)輸[5]。

1.1 細(xì)菌外膜囊泡的產(chǎn)生

電子顯微鏡的出現(xiàn)使得細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的研究得以展開。自從1963年與1965年的報(bào)道顯示革蘭陰性菌囊泡的存在，越來越多的研究表明革蘭陰性菌分泌囊泡狀物質(zhì)是一種普遍現(xiàn)象[6-9]。細(xì)菌外膜囊泡是球狀膜囊泡，其形成過程與細(xì)胞應(yīng)激密切相關(guān)(例如暴露于抗生素壓力下)。目前國(guó)際上關(guān)于細(xì)菌外膜囊泡形成機(jī)制有幾種解釋，包括局部膜重塑，脂多糖、肽聚糖及周質(zhì)空間膨壓的改變。最早之前，Burdett等[10]和Hoekstra等[11]關(guān)于OMVs生物發(fā)生的研究表明，肽聚糖(PG)和細(xì)菌外膜之間交聯(lián)的減少引發(fā)它們的形成。Mashburn等[12]提出當(dāng)細(xì)菌外膜磷脂，脂多糖和其他特定分子富集時(shí)細(xì)菌外膜的曲率變化導(dǎo)致OMVs產(chǎn)生。在銅綠假單胞菌上完成的工作揭示了由群體感應(yīng)分子PQS插入細(xì)菌外膜后會(huì)導(dǎo)致OMVs產(chǎn)生[13-14]。其他像正電荷化合物、螯合劑EDTA、改變外膜蛋白穩(wěn)定性還有高溫、抗生素壓力等環(huán)境因素也會(huì)導(dǎo)致OMVs的產(chǎn)生[1,15-17]。這些模型的共同假設(shè)是OMVs從外膜區(qū)域突出，肽聚糖與外膜之間交聯(lián)的破壞或者膨壓的增加導(dǎo)致外膜與肽聚糖層的解離。

1.2 細(xì)菌外膜囊泡的組成

由于細(xì)菌種類的不同以及細(xì)菌各自生態(tài)區(qū)位的差異，其外膜囊泡也展示出了不同的組成。雖然普遍認(rèn)為細(xì)菌外膜囊泡來源于外膜和周質(zhì)而不是內(nèi)膜或細(xì)胞質(zhì)，但越來越多的證據(jù)表明OMVs中攜帶脂多糖(LPS)、磷脂、肽聚糖、外膜蛋白(OMPs)、細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)(周質(zhì)、蛋白質(zhì)和膜結(jié)合)、核酸(DNA和RNA)等成分，并且OMVs除了經(jīng)典的直徑20～200nm不等的球狀結(jié)構(gòu)外，在其他細(xì)菌中還發(fā)現(xiàn)了管狀和細(xì)長(zhǎng)型結(jié)構(gòu)[18-19]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步，在OMVs中已經(jīng)鑒定出了很多屬于不同的功能類別蛋白質(zhì)[20]，例如大腸埃希菌MG1655中就鑒定出了幾百種蛋白質(zhì)其中包括一些蛋白酶和肽酶。Horstman等[21]報(bào)道甘油磷脂，磷脂酰甘油，磷脂酰乙醇胺和雙磷脂酰甘油是產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌OMVs中主要脂質(zhì)，其與OMVs的曲率相關(guān)。也有報(bào)道稱OMVs中存在一些不是細(xì)菌外膜成分的脂質(zhì)[22]。除了蛋白質(zhì)及脂質(zhì)成分，外膜囊泡腔和表面還攜帶相關(guān)的DNA和RNA，比如質(zhì)粒和噬菌體DNA。但核酸摻入OMVs的實(shí)際機(jī)制仍不清楚，有研究者猜測(cè)核酸可能是細(xì)菌裂解殘留物摻入OMVs中隨機(jī)帶入，也有一些學(xué)者認(rèn)為其生物發(fā)生過程并不是偶然[23-24]。

1.3 示蹤OMVs運(yùn)輸途徑的研究方法

目前已經(jīng)知道的OMVs進(jìn)入宿主細(xì)胞的途徑有巨胞飲、小窩蛋白、網(wǎng)格蛋白和脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞作用等[25]。但是探究OMVs進(jìn)入宿主細(xì)胞后具體的作用靶標(biāo)及信號(hào)通路依然是一個(gè)難題。為了找到一種快速高效的追蹤囊泡傳遞效應(yīng)物的方法，研究者們進(jìn)行了很多嘗試。Bauman等[26-28]研究者利用染料對(duì)外膜囊泡進(jìn)行標(biāo)記，這種染料可以實(shí)時(shí)顯示OMVs進(jìn)入宿主細(xì)胞、傳遞裝載物質(zhì)的過程，但這些染料也可能改變囊泡成分及生化特征導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。Martina等[29]研究者利用免疫學(xué)方法標(biāo)記與OMVs相關(guān)表位，這種方法特異性很好，但需實(shí)驗(yàn)前先將細(xì)胞進(jìn)行固定并且純化OMVs相關(guān)抗體。Kaparakis等[30-31]研究者利用宿主細(xì)胞表型上的特異性改變作為囊泡運(yùn)輸毒素進(jìn)入胞內(nèi)的一種指示。這種方法僅適用囊泡進(jìn)入細(xì)胞后有能觀測(cè)到明顯的標(biāo)志性特征。最近，O'Donoghue研究團(tuán)隊(duì)[32]提出了一種以囊泡靶向探針為導(dǎo)向的高靈敏度實(shí)時(shí)探究囊泡進(jìn)入宿主細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的方法。他們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞壁的組成會(huì)影響囊泡的攝取途徑以及后續(xù)的進(jìn)入動(dòng)力學(xué)和攝取效率，并且脂多糖O抗原的存在使囊泡可以繞過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞從而提高它們進(jìn)入宿主的效率。這些快速高效的研究囊泡進(jìn)入宿主并傳遞效應(yīng)物的方法是后續(xù)研究OMVs對(duì)宿主相關(guān)影響的基礎(chǔ)。

2 細(xì)菌外膜囊泡與抗生素

OMVs已被證明含有一系列膜相關(guān)蛋白，周質(zhì)蛋白和細(xì)胞質(zhì)成分，涉及重要的生物功能，包括信號(hào)傳導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、群體感應(yīng)和毒力。越來越多的研究表明細(xì)菌外膜囊泡與抗生素之間密切相關(guān)。并且，抗生素治療引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)菌外膜囊泡的產(chǎn)生有可能導(dǎo)致機(jī)體細(xì)菌感染的加重。

2.1 抗生素壓力刺激OMVs的分泌

抗生素壓力刺激可以調(diào)節(jié)OMVs的產(chǎn)生。腸出血性大腸埃希菌易造成嚴(yán)重的細(xì)菌感染并引發(fā)危及生命的溶血性尿毒綜合征。研究表明，環(huán)丙沙星，美羅培南，磷霉素和多黏菌素B能刺激腸出血性大腸埃希菌O104:H4和O157:H7中外膜囊泡的產(chǎn)生，并且環(huán)丙沙星還能上調(diào)OMVs中腸出血型大腸埃希菌主要毒力因子志賀毒素2a的產(chǎn)生。這些作用可能會(huì)惡化臨床上產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌造成的感染[33]。研究者的數(shù)據(jù)同時(shí)進(jìn)一步支持了現(xiàn)有“應(yīng)避免抗生素治療此類致病菌感染”的建議。隨著對(duì)常用抗生素頭孢菌素和碳青霉烯類耐藥的菌株的流行率增加，疾病的負(fù)擔(dān)和復(fù)雜性也隨著增加。

因此，必須了解致病菌感染發(fā)病機(jī)制及抗生素耐藥機(jī)制，以獲得替代的干預(yù)策略。慶大霉素是一種重要的抗生素，常與其他抗生素聯(lián)合用于治療嚴(yán)重的敗血癥。還有研究者探究了臨床上相關(guān)的應(yīng)激誘導(dǎo)條件下腸外致病性大腸埃希菌臨床分離株促炎性外膜囊泡的產(chǎn)生和組成，發(fā)現(xiàn)當(dāng)慶大霉素敏感菌株暴露于一系列不同濃度慶大霉素時(shí)，其外膜囊泡顆粒豐度有了增加；相反，在慶大霉素抗性菌株中則沒有觀察到增加?？梢哉f，OMVs的產(chǎn)生是革蘭陰性細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)的一部分，用來提高細(xì)菌在抗生素環(huán)境壓力下的存活能力[34]。

2.1.1 抗生素處理引起的細(xì)菌包膜應(yīng)激

抗生素處理引起細(xì)胞被膜壓力增加，例如研究者Kadurugamuwa等[35]發(fā)現(xiàn)多黏菌素和慶大霉素可以通過外膜的起泡而促進(jìn)外膜囊泡形成，研究者M(jìn)anning等[36]也證明了OMVs可以作為中和噬菌體和膜靶向抗生素的誘餌，從而幫助細(xì)菌細(xì)胞抵抗抗生素壓力。同樣，在銅綠假單胞菌中也發(fā)現(xiàn)慶大霉素能夠結(jié)合并破壞銅綠假單胞菌的細(xì)菌外膜，從而導(dǎo)致OMVs的釋放[37]。

2.1.2 抗生素處理引起的SOS應(yīng)答

抗生素治療有時(shí)候會(huì)因?yàn)檎T導(dǎo)SOS反應(yīng)和促進(jìn)細(xì)菌的囊泡增加從而加重細(xì)菌感染。SOS反應(yīng)是一種通過轉(zhuǎn)錄水平的應(yīng)答[38]，當(dāng)使用引起DNA損傷型抗生素特別是喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星處理細(xì)菌時(shí)通常會(huì)引起SOS反應(yīng)。SOS反應(yīng)又可以觸發(fā)由前噬菌體編碼的內(nèi)溶素的表達(dá)，從而引起裂解刺激囊泡形成。例如銅綠假單胞菌會(huì)通過SOS響應(yīng)來刺激外膜囊泡的產(chǎn)生[39]。研究者M(jìn)aredia等[40]發(fā)現(xiàn)喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星刺激下的銅綠假單胞外膜囊泡脂質(zhì)和細(xì)胞毒性水平均增加。然而，在無法激活SOS反應(yīng)的銅綠假單胞缺陷菌株中，環(huán)丙沙星應(yīng)激期間囊泡分泌的增加受到抑制，這表明SOS反應(yīng)在OMVs生物發(fā)生中的重要作用。使用絲裂霉素C處理痢疾志賀菌也會(huì)激活其SOS反應(yīng)，導(dǎo)致志賀毒素相關(guān)的OMVs水平增加，毒力增強(qiáng)。并且這種壓力誘導(dǎo)下的囊泡增加也可以促進(jìn)大腸埃希菌的存活率[41]。有趣的是，環(huán)丙沙星誘導(dǎo)分泌的外膜囊泡與亞胺培南誘導(dǎo)的外膜囊泡相比，在形態(tài)和蛋白含量方面存在顯著差異。這些研究結(jié)果暗示不同類型的抗生素可能誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的外膜囊泡。

2.1.3 抗生素抑制細(xì)胞壁合成，促進(jìn)囊泡的形成

β-內(nèi)酰胺類抗生素可以通過阻斷肽聚糖合成來破壞細(xì)胞壁完整性，在細(xì)菌肽聚糖層中產(chǎn)生空穴，細(xì)胞質(zhì)膜及內(nèi)含物可以通過這個(gè)空穴突出到細(xì)胞外空間從而刺激革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)囊泡的形成[3,42]。

2.2 OMVs在抗生素壓力下的保護(hù)性

2.2.1 OMVs能與氨基糖苷類抗生素結(jié)合

在環(huán)境中通常存在著幾種細(xì)菌群體共存的情況，研究者使用來自大腸埃希菌MG1655的OMVs處理銅綠假單胞菌及鮑曼不動(dòng)桿菌，發(fā)現(xiàn)其顯示出了膜活性抗生素如黏菌素、蜂毒肽、多黏菌素B處理下的保護(hù)性[43]。這種保護(hù)是通過隔離或降解膜活性抗菌分子來實(shí)現(xiàn)。然而，大腸埃希菌的OMVs不能保護(hù)任何這些細(xì)菌免于其他抗生素如環(huán)丙沙星、鏈霉素和甲氧芐啶的殺傷作用[2,36]。OMVs可以幫助細(xì)胞生存的第二種可能機(jī)制是通過OMVs的外膜來結(jié)合氨基糖苷類抗生素。研究表明，OMVs可以幫助抵抗多黏菌素，因?yàn)檫@種抗生素與OMVs結(jié)合后變得不穩(wěn)定。類似的，暴露于慶大霉素后細(xì)菌釋放的OMVs可以通過在OMVs被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)溶膠之前脫落上面結(jié)合的抗生素來幫助細(xì)菌增大存活的機(jī)率。釋放的OMVs還可以通過結(jié)合或吸收抗生素從而清除外部環(huán)境中的抗生素。

2.2.2 OMVs中含有具有活性的酶

早些時(shí)候已經(jīng)發(fā)現(xiàn)OMVs中含有β-內(nèi)酰胺酶，肽酶，蛋白酶和其他裂解酶等[44-47]，這些酶在OMVs中的穩(wěn)定存在暗示了其在抗生素方面的可能作用。近期對(duì)多重耐藥嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的研究表明，β-內(nèi)酰胺類抗生素會(huì)誘導(dǎo)其分泌更多的囊泡，并且分泌的OMVs被證明可以降解細(xì)胞外環(huán)境中的β-內(nèi)酰胺類抗生素[48]。研究者還發(fā)現(xiàn)在β-內(nèi)酰胺抗性大腸埃希菌的OMVs中，幾種可能參與降解β-內(nèi)酰胺類抗生素的蛋白質(zhì)含量更高，因此，來自β-內(nèi)酰胺抗性大腸埃希菌的OMVs可直接和劑量依賴性地降解β-內(nèi)酰胺抗生素，并使β-內(nèi)酰胺敏感的大腸埃希菌和其他細(xì)菌免受β-內(nèi)酰胺抗生素引起的生長(zhǎng)抑制。這些結(jié)果表明來自β-內(nèi)酰胺類抗性大腸埃希菌的OMVs在β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感細(xì)菌的存活中起重要作用。這一發(fā)現(xiàn)可能為抗擊當(dāng)前全球抗生素耐藥性擴(kuò)散提供一種新思路[49]。

2.2.3 OMVs可以增強(qiáng)藥物外排能力

生物膜是細(xì)菌產(chǎn)生的一種具有保護(hù)作用的表面黏附結(jié)構(gòu)，其中含有多糖、脂質(zhì)、核酸、蛋白、鞭毛、菌毛和OMVs等物質(zhì)。生物膜對(duì)細(xì)菌的生存以及耐藥性的獲得十分重要。在細(xì)菌生物膜中，OMVs是重要的成分。很多研究報(bào)道OMVs與銅綠假單胞菌生物膜的關(guān)聯(lián)[50-52]，可以設(shè)想在這種濃縮的OMVs環(huán)境中，通過這種基于囊泡作用的機(jī)制可以進(jìn)一步增強(qiáng)微生物生物膜的作用從而幫助細(xì)菌抱團(tuán)抵抗抗生素[1,50-51]。更重要的是，OMVs相關(guān)的多種藥物外排泵有助于易感細(xì)菌在抗生素環(huán)境中的短暫存活。藥物外排泵(efflux pumps)是存在于細(xì)菌細(xì)胞膜上的一類蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)菌可以通過外排泵系統(tǒng)將進(jìn)入胞內(nèi)的抗菌藥物泵出胞外，從而使菌體內(nèi)藥物濃度降低而導(dǎo)致耐藥[53]。在Kim等[49]的研究中，當(dāng)大腸埃希菌處于抗生素壓力環(huán)境下OMVs的產(chǎn)生可以通過去除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)、排出抗生素來幫助細(xì)胞存活更長(zhǎng)時(shí)間。細(xì)菌外膜囊泡相當(dāng)于給細(xì)菌藥物外排泵提供了一種有利武器。

2.2.4 OMVs介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的擴(kuò)散

核酸的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移是細(xì)菌進(jìn)化的固有特征，這種轉(zhuǎn)移可以通過自然轉(zhuǎn)化，結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)完成。很早就有研究表明在淋病奈瑟球菌中，含有青霉素抗性基因的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)移到青霉素敏感的淋球菌中[54]。近些年研究也進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)菌分泌的納米管及外膜囊泡也能幫助細(xì)菌完成耐藥基因的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。例如黏膜炎莫拉菌的OMVs能夠?qū)ⅵ?內(nèi)酰胺酶蛋白轉(zhuǎn)移到肺炎鏈球菌和流感嗜血菌中，從而促進(jìn)它們?cè)诎⒛髁执嬖谙碌拇婊頪55]。鮑曼不動(dòng)桿菌外膜囊泡中含有編碼β-內(nèi)酰胺酶的blaOXA-24基因而具有青霉素類和頭孢類抗生素抗性，并且隨著外膜囊泡的排出導(dǎo)致碳青霉烯耐藥的轉(zhuǎn)移[51]。

3 OMVs在減少抗生素耐藥方向的應(yīng)用

抗生素耐藥在全球范圍內(nèi)都是無法忽視的難題，如何延緩抗生素耐藥情況的惡化以及找到新的抗菌途徑是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。OMVs具有多種生物學(xué)和病理生理功能，在抑制細(xì)菌疾病復(fù)發(fā)及抵抗抗生素耐藥方面具有巨大潛力。例如來自擬桿菌的OMVs口服后可以通過腸黏膜屏障到達(dá)下面的上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[56]。有研究者提出利用天然衍生的OMVs的生物相容性和固有抗生素藥物載體的特性，將抗生素遞送到感染部位。例如將抗生素?fù)饺爰{米顆粒藥物載體作為一種增強(qiáng)抗菌效力及克服某些微生物耐藥性作為一種新的藥物開發(fā)策略。這種方式可以保護(hù)抗生素免于降解并減少副作用，但還需提高其靶向致病菌的選擇特異性。目前利用OMVs的生理特性已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了向組織遞送一系列治療性物質(zhì)(siRNA、microRNA和蛋白質(zhì))[57]。除此之外，研究者發(fā)現(xiàn)來自黏細(xì)菌的OMVs抑制大腸埃希菌的生長(zhǎng)與臨床建立的抗生素慶大霉素程度相當(dāng)，同時(shí)液相色譜耦合質(zhì)譜分析顯示在OMVs中存在抑菌成分。這項(xiàng)工作可以作為進(jìn)一步評(píng)估來自黏細(xì)菌的OMVs作為抗細(xì)菌感染的新型治療遞送系統(tǒng)的重要基礎(chǔ)[58]。另一方面，因?yàn)镺MVs對(duì)于宿主中細(xì)菌的存活及致病是必需的，所以外膜囊泡的調(diào)控也可以成為抗生素開發(fā)的潛在靶標(biāo)。

4 展望

細(xì)菌外膜囊泡在解決細(xì)菌耐藥這一難題方面有巨大潛力。盡管已有很多研究表明OMVs可以保護(hù)細(xì)菌免受抗生素的傷害，但很少詳細(xì)說明其保護(hù)的方式和程度。并且對(duì)于細(xì)菌外膜囊泡與抗生素相關(guān)的研究尚未系統(tǒng)化，抗生素進(jìn)入外膜囊泡的具體機(jī)制以及OMVs對(duì)細(xì)菌的保護(hù)性是否具有特異性或偏向性也有待闡明。未來，抗生素、細(xì)菌外膜囊泡及生物被膜之間聯(lián)系的闡明將有助于破解細(xì)菌耐藥性難題。