宛 洋

（沈陽市第十人民醫(yī)院，遼寧 沈陽 110044）

結(jié)核病是世界性難治疾病之一，雖然通過預(yù)防接種的方式一定程度上能夠?qū)υ摷膊∑鸬揭欢ǖ念A(yù)防作用，但仍然會(huì)出現(xiàn)許多成年人再發(fā)性結(jié)核感染病例結(jié)核分支桿菌。人群對(duì)于結(jié)核分支桿菌免疫力降低、結(jié)核分支桿菌出現(xiàn)抗原性變異以及耐藥性等因素是無法有效控制結(jié)核病的主要原因之一。經(jīng)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分支桿菌在出現(xiàn)細(xì)菌L型或細(xì)胞壁缺陷后，很有可能會(huì)造成結(jié)核病再發(fā)性感染。為了對(duì)抗菌藥物與抗結(jié)核藥物之間的作用關(guān)系以及結(jié)核分支桿菌L型有更加良好的了解，可以通過非高滲透壓培養(yǎng)基體外最低抑菌濃度試驗(yàn)，對(duì)抗結(jié)核藥物作用下結(jié)核分支桿菌的L型形成情況以及部分特殊性情況進(jìn)行觀察與研究，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 材料：本次實(shí)驗(yàn)研究所選用的材料主要包含結(jié)核分支桿菌菌種、培養(yǎng)基、抗結(jié)核藥物、抗菌藥物以及基因檢測試劑。結(jié)核分支桿菌菌種經(jīng)過20 d的培養(yǎng)基接種后，采取比濁法對(duì)蘇通培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋，經(jīng)過稀釋后的結(jié)核分支桿菌深度為每毫升1億個(gè)菌細(xì)胞。

1.1.2 培養(yǎng)基：本次實(shí)驗(yàn)研究所選用的功能培養(yǎng)基成分包含蒸餾水100 mL，甘油6 mL、枸櫞酸鐵銨0.005 g、MgSO4·7 H2O 0.05 g、K2HOP 40.05 g、枸櫞酸鹽0.2 g以及天門冬素0.4 g。

1.1.3 抗結(jié)構(gòu)藥物：本次實(shí)驗(yàn)研究所選取的抗結(jié)核藥物為乙胺丁醇、異煙肼以及利福平口服劑。利用蒸餾水分別對(duì)各種藥物進(jìn)行稀釋并將其加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)每毫升藥物的濃度為乙胺丁醇1、2.5、5 μg，異煙肼0.01、0.04、0.08 μg，利福平0.05、0.1、0.2 μg。

1.1.4 抗菌藥物：臨床治療用鏈霉素、林可霉素、氧氟沙星、慶大霉素、紅霉素和氯霉素注射劑以及諾氟沙星口服劑。將各種抗菌藥物利用蒸餾水分別對(duì)其進(jìn)行稀釋處理后將其加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)每毫升藥物的濃度為鏈霉素6 μg，諾氟沙星8 μg，林可霉素2 μg，氯霉素12.5 μg，慶大霉素4 μg，紅霉素2 μg，氧氟沙星2 μg。

1.1.5 基因檢測試劑：本次實(shí)驗(yàn)研究所取勝的基因檢測試劑為由華美生物工程公司所造成的PCR檢測試劑盒。

1.2 方 法

1.2.1 誘導(dǎo)與分離：于乙胺丁醇、異煙肼、利福平培養(yǎng)基中加各種結(jié)核分支桿菌，將其置于37 ℃的溫箱中，通過顯微鏡對(duì)L型的形成情況進(jìn)行觀察。待L型形成完畢后對(duì)其進(jìn)行過濾處理，于蘇通培養(yǎng)基中放置過濾物，將其置于37 ℃的溫箱中，對(duì)L型的生長情況進(jìn)行觀察。經(jīng)過密集生長階段后作磷鎢酸負(fù)染色、抗酸染色后鏡檢、革蘭染色后通過透射電鏡對(duì)其進(jìn)行觀察。同時(shí)也含有其他藥物、不含抗結(jié)核藥物的蘇通培養(yǎng)基內(nèi)接種結(jié)核分支桿菌，將其置于37 ℃的溫箱中，通過顯微鏡對(duì)L型生長情況和細(xì)菌進(jìn)行觀察。

1.2.2 敏感性實(shí)驗(yàn)：將L型非高滲透壓培養(yǎng)基傳代純培養(yǎng)物及結(jié)核分支桿菌細(xì)菌型菌液分別接種于抗結(jié)核藥物和不同抗菌藥物的蘇通培養(yǎng)基內(nèi)，通過顯微鏡對(duì)L型或結(jié)核分支桿菌的生長情況進(jìn)行觀察，對(duì)比不含藥物培養(yǎng)基中的生長情況。通過肉眼對(duì)培養(yǎng)基混濁情況進(jìn)行觀察，對(duì)藥物敏感性進(jìn)行判斷，通過顯微鏡對(duì)L型生長情況進(jìn)行判斷，并根據(jù)判斷結(jié)果對(duì)藥物敏感性進(jìn)行觀察。

1.2.3 對(duì)非高滲透壓培養(yǎng)基中的結(jié)核分支桿菌L型進(jìn)行分離提取，對(duì)L型進(jìn)行照像、瓊脂糖凝膠電泳以及DAN擴(kuò)增處理。

2 結(jié) 果

于培養(yǎng)基內(nèi)對(duì)抗結(jié)構(gòu)藥物進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)構(gòu)分支桿菌L型清晰可見。其中乙胺丁醇2.5 μg/mL和5 μg/ mL、異煙肼0.04 μg/ mL、利福平0.1 μg/mL下所生成的L型數(shù)量最多。再經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，雖未見細(xì)菌型生長，但發(fā)現(xiàn)L型數(shù)量明顯增加。

2.1 藥物敏感性分析：經(jīng)過為期15日的培養(yǎng)，鏈霉素6 μg/mL、氯霉素12.5 μg/mL、乙胺丁醇1 μg/ mL、異煙肼0.01 μg/ mL、利福平0.1 μg/mL培養(yǎng)基中的結(jié)核分支桿菌細(xì)菌型均未見生長，但可見L型。在林可霉素2 μg/ mL、諾氟沙星8 μg/mL、氧氟沙星2 μg/mL、慶大霉素4 μg/mL、紅霉素2 μg/mL培養(yǎng)基中均發(fā)現(xiàn)混濁情況，其中慶大霉素、氯霉素未見L型

2.2 L型的結(jié)核分支桿菌特異性基因：對(duì)L型的染色體DNA進(jìn)行電泳以及PCR擴(kuò)增處理后，可見與親代細(xì)菌型和陽性對(duì)照一致的帶型。

3 討 論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分支桿菌一方面具有肽聚糖，同時(shí)其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，也含有一定量的蛋白質(zhì)與脂類物質(zhì)。鏈霉素、乙胺丁醇、異煙肼、利福平是最為主要的抗結(jié)構(gòu)藥物，對(duì)于結(jié)核分支桿菌的蛋白質(zhì)、脂肪以及核酸代謝產(chǎn)生一定的抑制作用。通過本次實(shí)驗(yàn)研究可以發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分支桿菌對(duì)于鏈霉素、乙胺丁醇、異煙肼以及利福等藥物均具有殺菌以及抑制作用，對(duì)于L型無抑制作用。也就是在L型的狀態(tài)下，其細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及糖類物質(zhì)出現(xiàn)敏感性降低的現(xiàn)象。既在抗結(jié)核藥物的作用下，結(jié)核分支桿菌形成L型，一定程度上源自于抗結(jié)核藥物的無效與治療不徹底。因此，在臨床治療過程中，需要采取抗菌藥物與抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用的方法，能夠提高患者的治療有效性。