劉 明 何 歡

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712100）

刺梨（Rosa roxbunghii）屬于薔薇科多年生落葉灌木繅絲花果實(shí)，生長(zhǎng)在海拔500～2500m的向陽(yáng)環(huán)境中，果實(shí)中含有豐富的維生素C，被人們稱之為“維C之王”。刺梨的單寧含量0.19%～0.22%、總酸度1.20%～1.32%、總糖4.03%～6.17%。刺梨果實(shí)在發(fā)育中含有大量維生素，其維生素C的含量是橙子的50倍，是獼猴桃的12倍?；诖?，簡(jiǎn)單梳理分析刺梨果試中維生素C積累與相關(guān)酶活性的關(guān)系，通過(guò)試驗(yàn)方式進(jìn)行論證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇3年生刺梨100g，取部分直接測(cè)定鮮重以及干重，將剩余的樣品通過(guò)液氮進(jìn)行處理，將其保存在-20℃的環(huán)境中。分析去皮果肉，測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2 刺梨果試鮮重以及干重測(cè)定

隨機(jī)稱取10個(gè)刺梨果實(shí)計(jì)算鮮重和平均重量，115℃下殺酶20～30min，在65℃下烘干到恒重量，計(jì)算分析平均單果的干物質(zhì)重量。

1.3 測(cè)定AsA以及DHA含量

稱取1～2g刺梨果肉，在4℃之下5%的偏磷酸中研磨形成漿液，避免出現(xiàn)氧化、降解。然后在4℃之下16000g離心處理20min，收集上清液，測(cè)定AsA以及DHA含量。在測(cè)定時(shí)，要在反應(yīng)體系中加入濃度為1.25U/mL的AAO以及2mmol/L的DTT，進(jìn)行AsA氧化處理以及DHA的還原處理。通過(guò)紫外分光光度法，測(cè)量在265nm之下的吸光值變化。AsA以及DHA溶液通過(guò)相同的方式制作形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中總的AsA=AsA+DHA。

1.4 測(cè)定水溶性總糖含量、還原糖含量以及蔗糖含量

稱取1g的刺梨果肉，進(jìn)行水溶性總糖、還原糖以及蔗糖含量的測(cè)定。稱取樣本之后，加入3mL的蒸餾水，搖均之后加入8mg的濃酸鹽，然后在100℃的水浴中水解2h，將其過(guò)濾定容到100mL容量瓶中，通過(guò)金氏定糖法顯色，上機(jī)處理，在620±0.5nm的波長(zhǎng)之下，測(cè)定總糖數(shù)據(jù)。稱取樣本，加入蒸餾水，搖均之后溶解、過(guò)濾，通過(guò)金氏定糖法顯色，在比色杯中測(cè)定數(shù)據(jù)，獲得還原糖數(shù)據(jù)。稱取樣本，加入蒸餾水，搖均之后再溶解、過(guò)濾，通過(guò)ROe比色法顯色上機(jī)，在500±0.5的納米波長(zhǎng)之下，在石英比色杯中測(cè)定蔗糖數(shù)據(jù)。

1.5 GalLDH活性測(cè)定

稱取2g的刺梨果肉放置在5mL含有400mmol/L的蔗糖、100mmol/L磷酸鉀緩沖溶液中進(jìn)行研磨，形成均勻的漿液，再通過(guò)2層紗布過(guò)濾處理。在濾液300g之下離心10min，然后收集上清液，再放置在10000g的離心中20min，收集沉淀物。將沉淀懸浮放在0.5mL且含有400mmol/L的蔗糖、100mmol/L磷酸鉀緩沖液中監(jiān)測(cè)酶活性。

在2.4mL的反應(yīng)體系中，含有2mL 1.005mg/mL的細(xì)胞色素C、200L 56mmol/L的半乳糖內(nèi)脂；200L的提取液，在測(cè)定之前要將混合液放在25℃中預(yù)溫度，時(shí)間為1min，反應(yīng)則要在加入了半乳糖內(nèi)脂之后再計(jì)時(shí)分析。

1.6 AAO、AAP、MDAR、DHAR活性測(cè)定

稱取1～2g的刺梨果肉，在含有0.3mol/L的甘露糖、0.1%的 BSA1、1mmol/L 的 EDTA、0.05%的半胱氨酸、2%的PVP以及50mmol/LTris-HCl，pH值為7.2的緩沖液4℃中研磨。在16000g離心處理20min，收集整理上清液，通過(guò)分光光度計(jì)法測(cè)定酶活性，重復(fù)測(cè)定3次以上。

2 刺梨果試中維生素C積累與相關(guān)酶活性的關(guān)系結(jié)果分析

基于試驗(yàn)分析，討論刺梨果試中維生素C積累與相關(guān)酶活性的關(guān)系，探究果試鮮重以及干重變化、AsA以及DHA含量變化、碳水化合物含量變化以及Gall DH活性變化以及AsA積累關(guān)系、AAO、AAP、MDAR、DHAR活性變化，具體如下：

2.1 果試鮮重以及干重變化

通過(guò)分析刺梨果試發(fā)育狀況可以發(fā)現(xiàn)，刺梨在發(fā)育中其鮮重以及干重呈現(xiàn)持續(xù)增加的狀態(tài)，增加幅度存在起伏變化。刺梨果試的鮮重在8月中旬之后會(huì)逐漸減緩增長(zhǎng)，而干物質(zhì)會(huì)持續(xù)積累，這樣就會(huì)增加果試密度，有利于提升刺梨品質(zhì)。而基于刺梨幼果發(fā)育在成熟期間中一共持續(xù)3個(gè)月時(shí)間。

2.2 刺梨果試發(fā)育AsA以及DHA含量變化

在刺梨果試發(fā)育中，AsA積累速率呈現(xiàn)“慢——快——慢”的變化趨勢(shì)。在6月份AsA會(huì)逐漸累積，而在6月底則就會(huì)增加積累量。在20d時(shí)，凈累積量是整體累積量中的一小部分，為整體的8%；在40d時(shí)，刺梨果試的AsA累積量則是較為重要的階段，凈累積量為整體的90%；在刺梨成熟階段，AsA幾乎不會(huì)在逐漸累積，而部分果試中AsA會(huì)輕微降低。DHA含量在刺梨發(fā)育早期水平較高，然后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，然后逐漸上升，再次下降，7月份時(shí)呈現(xiàn)緩慢的升高趨勢(shì)。而從整體上來(lái)說(shuō)，刺梨果試中的DHA相對(duì)較少，是AsA的少量部分。

2.3 刺梨果試生長(zhǎng)過(guò)程中碳水化合物的含量變化

刺梨果試在發(fā)育初期階段，水溶性總糖以及蔗糖含量會(huì)出現(xiàn)略微下降，但是AsA幾乎沒(méi)有積累；而在成長(zhǎng)階段，AsA會(huì)快速累積，水溶性總糖以及蔗糖含量相對(duì)較高，在整個(gè)期間中還原糖處于最低水平。這種變化表明，在果試中含有的葡萄糖、果糖以及半乳糖等還原糖的組分是通過(guò)部分AsA合成。在蔗糖處于發(fā)育期中含量最高的階段中，刺梨的還原糖呈現(xiàn)最低水平，而可溶性總糖含量也略微降低。分析整個(gè)發(fā)育過(guò)程，這3種類型的糖水平與AsA累積量并沒(méi)有顯著的直線關(guān)系。

2.4 刺梨果試發(fā)育與Gall DH活性變化以及AsA積累關(guān)系

Gall DH在6月中旬快速增加，在8月中旬水平較高，這也是AsA積累較高的階段。隨著果實(shí)的不斷成熟，Gall DH活性逐漸降低，AsA也停止積累。從整體上來(lái)說(shuō)，刺梨果實(shí)中的Gall DH活性變化以及AsA積累的變化趨勢(shì)基本一致。

2.5 刺梨果試發(fā)育中AAO、AAP、MDAR、DHAR活性變化

AAO、AAP是植物體內(nèi)中氧化AsA的主要酶，通過(guò)與氧氣與水的參與，將AsA氧化形成不穩(wěn)定狀態(tài)的單脫氫抗壞血酸，進(jìn)而形成DHA。在刺梨果實(shí)發(fā)育中，短時(shí)間可以檢測(cè)出這2種酶的活性；而在AsA的快速積累以及果試成熟階段則無(wú)法檢測(cè)其活性。AsA在發(fā)育中，刺梨果實(shí)中積累的AsA只有少數(shù)會(huì)被氧化，其會(huì)積累大量的AsA。

3 結(jié)論

刺梨果試AsA積累較高，刺梨果試在發(fā)育中，Ga1LDH可以長(zhǎng)期維持高活性，維持合成AsA。而Ga1LDH活性變化與AsA積累量之間存在正相關(guān)關(guān)系，因此，刺梨合成的AsA含量大部分是受到Ga1LDH活性的影響與調(diào)節(jié)。而在刺梨的不同器官中，AsA的積累量以及與Ga1LDH基因表達(dá)的水平則具有協(xié)同性特征，也就是說(shuō)，在AsA積累量較高的器官中，Ga1LDH基因表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)。對(duì)此，而AsA在合成中，氧化損失較少，可以提升AsA的積累。