孫燕，葛斐林，薛春苗，曹俊嶺，*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700

五環(huán)三萜類(lèi)(Pentacyclic Triterpenoids，PT)是一類(lèi)分布廣泛的天然活性物質(zhì)，有六個(gè)異戊二烯單元聯(lián)結(jié)而成，由5個(gè)閉合環(huán)作為母體，并以游離或苷類(lèi)形式存在于自然界中，尤其是存在于一些中國(guó)的傳統(tǒng)天然藥物中[12-13]。PT按其核心結(jié)構(gòu)分為：齊墩果烷型、熊果烷型、羽扇豆烷型、何帕烷型和木栓烷型五大類(lèi)；并根據(jù)它們的羥基和羧酸基團(tuán)的數(shù)目、位置進(jìn)一步分類(lèi)為三萜單醇、三萜二醇、三萜酸等。這類(lèi)化合物有著廣泛的藥理活性，包括抗炎、肝保護(hù)、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗真菌、胃保護(hù)和抗高血脂作用等，其抗腫瘤活性一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1-11]。PT類(lèi)化合物具有低揮發(fā)性和低極性，在早期的一些研究中，由于有限的檢測(cè)方法或?qū)φ掌?，這些化合物通常被檢測(cè)為復(fù)合物。而PT是一類(lèi)具有相同骨架但取代基不同的類(lèi)似物，不同取代基的生物活性會(huì)有很大差異，生物合成屬于同步合成但合成量不同，更難以檢測(cè)[14]。隨著分析技術(shù)日益發(fā)展，將這些技術(shù)應(yīng)用到PT的分離分析中是大勢(shì)所趨，不僅有利于更好地提取傳統(tǒng)中藥的活性物質(zhì)，而且針對(duì)PT中含量少但生物活性較高的成分，發(fā)掘來(lái)源相對(duì)豐富的天然產(chǎn)物例如藥食同源產(chǎn)品，是理想、經(jīng)濟(jì)的解決途徑。所以一個(gè)高選擇分離和高靈敏檢測(cè)技術(shù)是藥食產(chǎn)品中PT準(zhǔn)確測(cè)定的關(guān)鍵點(diǎn)。為此本文在總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上，結(jié)合最新研究動(dòng)態(tài)，對(duì)PT的檢測(cè)方法及其在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

1 PT的色譜分離方法

1.1 薄層色譜法(TLC)

Shiojima等[15]在最初進(jìn)行PT類(lèi)化合物的分離時(shí)，是先用硝酸銀浸漬硅膠柱，之后在制備過(guò)的硅膠柱上上樣。Martelanc等[16]則第一次使用C18反相高效薄層色譜板分離鑒定出ɑ-香樹(shù)脂醇、β-香樹(shù)脂醇、羽扇豆醇、羽扇豆醇乙酸酯、熊果酸、齊墩果酸等幾種常見(jiàn)PT異構(gòu)體化合物。因?yàn)闆](méi)有樣品預(yù)處理，故植物提取物中PT的篩選分析快速、簡(jiǎn)單。Sethiya等[17]在前人的基礎(chǔ)上，使用了高性能薄層色譜法(HPTLC)，用于分析印度一種阿育吠陀藥用植物Shankhapushpi中熊果酸、白樺酸、豆甾醇和羽扇豆醇，可以將三萜酸和植物甾醇進(jìn)行分離，證明高性能薄層色譜法是分析大量復(fù)雜自然樣本的有效工具。

綜上TLC優(yōu)勢(shì)：分離效率高，特別適用于各種復(fù)雜化合物的快速篩選；同時(shí)樣品純化步驟是最少的。缺陷：需要大量的樣品，在硅膠薄層色譜板的分離最低檢出限(LOD)在μg·mL-1水平；需要有毒的碘衍生和甲基化，耗時(shí)。

1.2 氣相色譜法(GC)

Macías等[18]早在研究清漆中的苔蘚樹(shù)脂時(shí)，運(yùn)用裂解氣相色譜-質(zhì)譜法(GLC)，提出用氯甲酸甲酯為衍生化試劑。建立了作為主要PT化合物的ɑ-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇檢測(cè)方法，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在樹(shù)脂中，何帕-22(29)-烯與兩個(gè)香樹(shù)脂醇一起存在。然而，何帕-22(29)-烯屬于何帕烷型五環(huán)三萜，是樹(shù)脂的標(biāo)記化合物。Pérez-Camino等[19]先用鍵合的氨丙基試劑提取植物油，提取液經(jīng)硅烷化后用固相法分離出酸性組分，后用GC分析，定量測(cè)定植物油中的痕量五環(huán)三萜酸：齊墩果酸、山楂酸和熊果酸，深入挖掘了植物油中的酸性組分。之后Janicsák 等[20]針對(duì)藥用植物中三萜酸：齊墩果酸和熊果酸，同樣使用GC進(jìn)行分離與含量測(cè)定。Sousa等[21]用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)研究了整個(gè)工業(yè)過(guò)程軟木和軟木副產(chǎn)物中親脂性萃取物的化學(xué)組成。發(fā)現(xiàn)軟木提取物中除了有脂肪族、酚類(lèi)，還有PT，主要包含木栓酮、樺木素、白樺脂醇、樺木酸，且工業(yè)副產(chǎn)物可被認(rèn)為是PT類(lèi)或有望合成PT的中間體的來(lái)源。Silveira等[22]在藥用植物大葉錦雞兒葉、果、莖和樹(shù)皮提取物中發(fā)現(xiàn)PT次生物質(zhì)，包括羽扇豆醇、羽扇豆酮、樺木酸、樺木素、木栓酮和木栓醇，并用GC-MS定量定性。先將干燥的己烷提取物懸浮在甲醇中，之后進(jìn)行衍生化：60 ℃下加入100 μL雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺試劑(BSTFA)反應(yīng)30 min，將衍生后的樣品注入氣相色譜儀，用Agilent HP 5-ms毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm)實(shí)現(xiàn)分析物的分離。Pereira等[23]用GC-MS同時(shí)定量定性海洋生物海參中幾類(lèi)代謝產(chǎn)物，其中包含3種羽扇豆烷型三萜：白樺脂醇、羽扇豆醇、羽扇豆醇乙酸酯。Jemmali等[24]先用GC-MS對(duì)11種標(biāo)準(zhǔn)混合物：ɑ-香樹(shù)脂醇、β-香樹(shù)脂醇、羽扇豆醇、高根二醇、熊果醇、樺木素、齊墩果酸、樺木酸、熊果酸、山楂酸和科索羅酸進(jìn)行衍生化試驗(yàn)，然后用于分析4種植物：蘋(píng)果、鼠尾草、沙棘和樹(shù)脂的提取物。混合物通過(guò)硅烷化或乙?；苌?，且PT化合物的衍生化只發(fā)生在母環(huán)上的一類(lèi)或兩類(lèi)官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，而不是全部。該衍生化方案僅適用于含羧酸PT：齊墩果酸、科索羅酸、樺木酸、山楂酸和熊果酸，以及二羥基衍生物：高根二醇和熊果醇；而含單羥基的PT類(lèi)化合物：ɑ-香樹(shù)脂醇、β-香樹(shù)脂醇、樺木素、羽扇豆醇無(wú)需衍生。

綜上GC優(yōu)勢(shì)：適用于非極性生物活性組分，也適用于分離位置異構(gòu)體。缺陷：由于PT的揮發(fā)性低，在上樣測(cè)定之前需要耗時(shí)的樣品預(yù)處理，即不可缺少的衍生化步驟，而衍生化過(guò)程是定量中潛在的不確定性因素；此外由于過(guò)長(zhǎng)的保留時(shí)間，樣品可能降解。

1.3 液相色譜法(LC)

Martelanc等[25]用高效液相色譜法分離PT幾個(gè)三萜醇異構(gòu)體：羽扇豆醇、ɑ-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇，方法是通過(guò)使用ODS柱，用乙腈-水(95∶5)在40 ℃下等溫洗脫32 min。Zhao等[26]用HPLC建立了白樺樹(shù)皮中樺木素和樺木酸同時(shí)提取和測(cè)定的方法。優(yōu)化了不同提取溶劑：二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、甲醇和95%乙醇對(duì)樺木素和樺木酸提取率。結(jié)果表明，95%乙醇是一種較好的提取溶劑，可提取高含量的PT。通過(guò)在反相C18柱上用乙腈-水(86∶14)實(shí)現(xiàn)白樺脂素和白樺脂酸的分離，同時(shí)也比較了中國(guó)生長(zhǎng)在不同地點(diǎn)的白樺樹(shù)皮中樺木素和樺木酸含量的顯著變化。Jin等[27]為了實(shí)現(xiàn)LC系統(tǒng)的最大靈敏度和選擇性，優(yōu)化了色譜條件。UPLC測(cè)定酸性化合物時(shí)，流動(dòng)相經(jīng)常酸化，以改善色譜峰的形狀和保留時(shí)間。因此，對(duì)含有0.05%、0.1%、0.5%甲酸的水，或0.05%、1.5%、3%乙酸水溶液進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，用0.05%乙酸酸化效果最好，可以觀察到色譜圖中山楂酸保留時(shí)間為20.9 min，并有良好的峰形和面積。相反，用較高濃度的乙酸時(shí)，觀察到山楂酸沒(méi)有色譜峰。而沒(méi)有選擇甲酸，是因?yàn)樗鼘⑸介岬谋Ａ魰r(shí)間延遲到29 min。此外對(duì)有機(jī)溶劑甲醇和乙腈進(jìn)行了評(píng)價(jià)，因?yàn)榧状嫉淖贤馕盏陀?83 nm，不適合PT類(lèi)化合物的紫外檢測(cè)，而且甲醇也總是觀察到遺留效應(yīng)。故有機(jī)溶劑采用乙腈。為獲得最佳提取效率對(duì)液-液萃取不同的提取溶劑進(jìn)行了評(píng)價(jià)，在各種溶劑中，篩選出甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯。其中乙腈和乙醇回收率小于75%，甲醇回收率為(89.3±1.4)%，而乙酸乙酯回收率大于95%，并有較少的干擾峰，故選乙酸乙酯做萃取溶劑。

綜上LC優(yōu)勢(shì)：比GC有更大的承載量，無(wú)需衍生化；對(duì)于定量來(lái)說(shuō)，HPLC更具有可重復(fù)性，且UPLC與傳統(tǒng)HPLC相比分辨率更大、靈敏度提高、分析速度快。缺陷：因PT同分異構(gòu)體眾多，HPLC也不能實(shí)現(xiàn)完全分離。

1.4 毛細(xì)管電泳色譜法(CZE)

CZE分析PT早在幾年前被人們所研究利用。Qi等[28]用簡(jiǎn)單的非水毛細(xì)管電泳(NACE)實(shí)現(xiàn)了中藥中3種PT化合物熊果酸、齊墩果酸和2ɑ，3β，24-三羥基-熊果-12-烯-28-羧酸的同時(shí)分離。采用甲醇-乙腈(65∶35)對(duì)混合物進(jìn)行電泳，獲得了良好的分離和相關(guān)系數(shù)。因NACE工作原理是基于電解質(zhì)溶液的使用，故有機(jī)溶劑的改變使它們?cè)谖锢砗突瘜W(xué)性質(zhì)上有很大不同(如黏度、介電常數(shù)、與水之間的導(dǎo)電性等)，從而有利于PT在NACE中進(jìn)行選擇性分離。同時(shí)，該方法用于5種中草藥：石楠葉、澤蘭、夏枯草、女貞子、馬鞭草提取物中這3種組分的分離和測(cè)定。膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法(MEKC)是最常用的，之前也有用MEKC對(duì)硅烷基化的PT進(jìn)行分離，但對(duì)于熊果酸和齊墩果酸，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)非常相似，即使是MEKC也沒(méi)有獲得很好的分辨率。Cheung等[29]建立了環(huán)糊精修飾的CZE分離夏枯草中PT的3種三萜酸異構(gòu)體：熊果酸、齊墩果酸和樺木酸的方法。用硼砂緩沖液，包含40 mm硼砂、2 mm環(huán)糊精和4%甲醇，pH 9.4，在25 kV電壓、25 ℃溫度下運(yùn)行，20 min內(nèi)彼此很好地分離，遷移時(shí)間的RSD為0.16%～0.74%。期間為了改善CZE的分辨率，向背景緩沖液中加入添加劑環(huán)糊精(CD)，原理是溶質(zhì)與CD、溶質(zhì)和毛細(xì)管壁、CD和毛細(xì)管壁的相互作用，特別是手性分子分離的相互作用，增加的分離效率可以歸因于降低手性分離中的相互作用。但由于修飾后對(duì)毛細(xì)管壁的吸附減少，且齊墩果酸和熊果酸的結(jié)構(gòu)相似，沒(méi)有像NACE和MEKC一樣獲得基線(xiàn)分離。Ren等[30]之后也用CZE方法來(lái)識(shí)別連翹中以上3個(gè)微量三萜酸組分，在背景電解質(zhì)丁基縮水甘油醚(BGE)中最終實(shí)現(xiàn)了CZE對(duì)3個(gè)三萜酸組分的基線(xiàn)分離。

綜上CZE優(yōu)勢(shì)：具有分離效率高、樣品和溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。缺陷：需衍生化，分離時(shí)間長(zhǎng)；由于存在非揮發(fā)性緩沖液，該方法不能與質(zhì)譜聯(lián)用。

1.5 超臨界流體色譜法(SFC)

Tavares等[31]最早用毛細(xì)管超臨界流體色譜法分離一些無(wú)需衍生的三萜酸：樺木酸、齊墩果酸、山楂酸和熊果酸。因之前SFC研究?jī)H集中在PT餾分的表征上，沒(méi)有評(píng)價(jià)超臨界流體提取過(guò)程參數(shù)的影響，故Mossi等[32]用馬尾藤做了優(yōu)化提取。用高壓二氧化碳(CO2)萃取，從提取物的液體產(chǎn)量和化學(xué)成分來(lái)看，分析條件結(jié)果表明：CO2顆粒大小和流率不影響提取物產(chǎn)量，而萃取溫度和溶劑密度對(duì)提取物液體產(chǎn)率和化學(xué)性質(zhì)都有顯著影響。Lesellier 等[33]將超臨界流體色譜/蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(SFC/ELSD)聯(lián)用，為快速分析PT類(lèi)化合物提供了高分辨率和高響應(yīng)性，其優(yōu)化的分析條件：改性劑(10%～3%)；背壓(12～18 MPa)和溫度(15～25 ℃)，從而提高了分離，該方法檢測(cè)了蘋(píng)果渣中8種PT類(lèi)化合物：齊墩果酸、高根二醇、β-香樹(shù)脂醇、熊果酸、熊果醇、樺木酸、樺木素、羽扇豆醇。在等度洗脫條件，不到20 min即可分離。然而，由于沒(méi)有質(zhì)譜定性，仍然有難以識(shí)別的同分異構(gòu)體存在。此外，因?yàn)榱鲃?dòng)相中沒(méi)有水，化合物與固定相的相互作用與反相液相相比，流體粘度低、流速大、效率高，使用SFC/ELSD能在相當(dāng)短的分析時(shí)間內(nèi)得到較滿(mǎn)意的分辨率。

綜上SFC優(yōu)勢(shì)：CO2在食品和醫(yī)藥工業(yè)內(nèi)被用作超臨界萃取溶劑，因?yàn)樗鼰o(wú)毒，不易燃，非爆炸性，容易獲得，并具有低臨界溫度，可避免熱敏化合物的降解；SFC適用于中極性或低極性化合物中，且無(wú)需衍生化、分離時(shí)間短、分離效率高。缺陷：由于流動(dòng)相為氣體，與質(zhì)譜聯(lián)用的儀器貴且少，其余的檢測(cè)器對(duì)定性來(lái)說(shuō)不夠精準(zhǔn)。

1.6 多孔石墨碳(PGC)

Rhourrifrih等[34]首次研究了PGC固定相分離PT異構(gòu)體?？疾炝瞬煌瑓?shù)：溫度、甲酸濃度及流動(dòng)相組成對(duì)保留率的影響。PGC工作原理是主要由石墨的可極化表面引起，具有高疏水性、極性和離子相互作用，特別適合分離異構(gòu)體。研究表明，隨著溫度的升高，PT的保留量降低，因此，在25 ℃下選擇乙腈-異丙醇混合物作為梯度洗脫的流動(dòng)相，進(jìn)行樹(shù)脂中PT的分離。Bérangère等[35]同樣使用PGC快速分析了幾種三萜酸：樺木酸、齊墩果酸、熊果酸、18ɑ-和18β-甘草次酸。

綜上PGC優(yōu)勢(shì)：PGC具有平面結(jié)構(gòu)，這對(duì)于分離結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)的分子非常有用，包括異構(gòu)體、微極性、極性和離子化合物，都得到了廣泛的應(yīng)用。缺陷：機(jī)械性能差，難以承受HPLC的高壓操作，實(shí)際應(yīng)用范圍窄。

2 PT的波譜檢測(cè)技術(shù)

2.1 紫外(UV)與熒光(FLD)檢測(cè)器

Zhao等[26]用HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定樺木素、樺木酸，而這兩種PT分子具有相似的分子結(jié)構(gòu)，且大多數(shù)PT類(lèi)化合物缺乏發(fā)色團(tuán)，通常在200 nm波長(zhǎng)直接進(jìn)行UV檢測(cè)。故UV檢測(cè)器不利于低濃度的定量，而UV測(cè)定PT的前提是含量足，才能增強(qiáng)使用UV的檢測(cè)信號(hào)。Wu等[36]用HPLC-FLD測(cè)定了6種三萜酸：熊果酸、齊墩果酸、樺木酸、山楂酸、白樺脂酮酸和科羅索酸，三氯甲烷和丙酮做提取與分散溶劑。然而，因?yàn)槿狈线m的熒光部分，需采用柱前衍生來(lái)增強(qiáng)三萜酸分子的選擇性、靈敏度。

綜上UV與FLD優(yōu)勢(shì)：價(jià)格相對(duì)便宜。缺陷：PT化合物缺乏發(fā)色團(tuán)和熒光部分，這限制了流動(dòng)相的選擇并減少了UV與FLD檢測(cè)的靈敏度；目前耦合UV/FLD檢測(cè)提供的LOD僅在μg·mL-1水平。

2.2 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)

Tian等[37]用HPLC-ELSD測(cè)定紫菀中的三大類(lèi)PT化合物：紫菀酮、木栓酮和表木栓酮并同時(shí)進(jìn)行定量，在反向C18柱上用乙腈梯度洗脫獲得最佳色譜條件，并在ELSD設(shè)定0.05%乙酸在40 ℃蒸發(fā)。同時(shí)比較了HPLC-UV和HPLC-ELSD下三大類(lèi)PT化合物和樣品紫菀的色譜圖，發(fā)現(xiàn)UV檢測(cè)在200 nm處雖然可以檢測(cè)到紫菀酮和木栓酮，但信號(hào)比在相同濃度下由ELSD檢測(cè)產(chǎn)生的信號(hào)弱得多，所以HPLC-ELSD靈敏度比HPLC-UV大得多。

綜上ELSD優(yōu)勢(shì)：避免衍生步驟而導(dǎo)致的樣品減少，ELSD也越來(lái)越多地被用于非發(fā)色物質(zhì)分析的通用檢測(cè)器；使用ELSD響應(yīng)顯著高于UV檢測(cè)所提供的響應(yīng)。缺陷：基線(xiàn)噪聲大，靈敏度低。

2.3 火焰離子化檢測(cè)器(FID)

Stiti等[38]使用GC結(jié)合FID分析了歐洲橄欖果實(shí)發(fā)育過(guò)程中PT的形成，并對(duì)PT定性和定量。從橄欖樹(shù)開(kāi)花后的不同階段到果實(shí)發(fā)育，分析橄欖果實(shí)的游離甾醇和PT含量。甾醇和PT是通過(guò)乙酸/異戊二羥酸途徑合成的，由共同的前體氧化鯊烯形成。在果實(shí)發(fā)育開(kāi)始時(shí)，發(fā)現(xiàn)橄欖果含有大量的ɑ-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇，以及更多的含氧化合物，如三萜二醇(高根二醇和熊果醇)和三萜酸(齊墩果酸、熊果酸和山楂酸)。當(dāng)橄欖果達(dá)到了最后成熟，開(kāi)始從綠色變成紅色到紫色，ɑ-香樹(shù)脂醇和β-香樹(shù)脂醇不再存在。

綜上FID優(yōu)勢(shì)：有利于分離鑒定PT的位置異構(gòu)體。缺陷：需要色譜衍生，化合物的非揮發(fā)性又延長(zhǎng)了分析時(shí)間。

2.4 PT的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)

質(zhì)譜作為一種重要的分析方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、食品科學(xué)、制藥行業(yè)等領(lǐng)域[39]，特別適合于分析植物復(fù)雜基質(zhì)中的三萜成分，以克服基質(zhì)抑制效應(yīng)。由于PT化合物類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分離效果很差。而檢測(cè)器中光譜僅有一些峰相對(duì)強(qiáng)度的差異，無(wú)法很好地識(shí)別同分異構(gòu)體；質(zhì)譜卻可以在PT鑒定中可分析出位置異構(gòu)體，能夠很好地識(shí)別和量化實(shí)際樣品中的化合物，并有助于對(duì)未知化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。這表明，良好的質(zhì)譜分析法對(duì)于明確鑒定含相同的分子量或碎片的PT類(lèi)化合物是必需的。

2.4.1 飛行時(shí)間質(zhì)譜(QTOF) Mcghie等[40]研究了7個(gè)品種的蘋(píng)果皮中三萜酸組成，并測(cè)定其抑制脂肪酶的活性，利用高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(HPLC-QTOF-HRMS)獲得了43種化合物的準(zhǔn)確質(zhì)量信息，包括元素組成，片段質(zhì)量。這43種化合物被鑒定為三萜酸并初步鑒定為含有羥基、羧基的熊果酸(或齊墩果酸)及其衍生物。但這里質(zhì)譜給出的信息沒(méi)有確定羥基、羧基位置以及同分異構(gòu)體組的結(jié)構(gòu)(ɑ vsβ，順式vs反式)。研究表明，PT類(lèi)化合物的質(zhì)譜碎裂為diels-alder反應(yīng)，環(huán)C斷裂產(chǎn)生兩個(gè)雙環(huán)片段，這兩個(gè)片段的識(shí)別證實(shí)了PT類(lèi)化合物19位羥基的位置可作為分子斷裂的識(shí)別點(diǎn)。而蘋(píng)果提取物中的三萜酸對(duì)于化學(xué)修飾，集中在C-3羥基，C-12、C-13雙鍵和C-28羧酸上，這些修飾可以產(chǎn)生更有效的化合物，或提高它們的生物利用度。

2.4.2 三重四極桿質(zhì)譜(QQQ) Sánchezavila等[41]在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-QQQ-MS)的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)下，快速、選擇性地測(cè)定微波輔助提取后橄欖葉中PT類(lèi)化合物：三萜酸(齊墩果酸、熊果酸和山楂酸)；三萜二醇(熊果醇、高根二醇)。由于三萜酸和二醇為中等極性，使用乙醇作為微波輔助萃取劑在5 min內(nèi)完成了橄欖葉的提取。相比以往通常需要至少5 h的浸漬，在微波輔助下顯著縮短了浸出時(shí)間。萃取后，用HPLC-QQQ-MS，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)證實(shí)了PT類(lèi)的選擇性鑒定，在25 min內(nèi)完成成分表征。此外超聲波輔助浸出技術(shù)、加壓液體萃取和超臨界流體提取均可供浸出輔助應(yīng)用，可以大大減少提取體積和縮短加工時(shí)間。雖然QQQ適合于定性分析，對(duì)于定量不夠精確，但可以初步闡明每個(gè)PT類(lèi)化合物的指紋特征。

2.4.3 四極桿-軌道質(zhì)譜(Orbitrap) Sánchez-González等[42]用高效液相色譜-四極桿軌道質(zhì)譜法(HPLC-Orbitrap-MS)鑒別橄欖內(nèi)山楂酸在大鼠血漿和尿液中的代謝，以更好地了解這種三萜酸化合物的生物效應(yīng)。因橄欖經(jīng)生物利用后，代謝物屬于生物體內(nèi)的微量小分子，故用高分辨質(zhì)譜法進(jìn)行定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山楂酸在血漿(81.8%)和尿(73.9%)中均高濃度存在，這表明山楂酸代謝較低。而山楂酸已被評(píng)估為未來(lái)營(yíng)養(yǎng)藥物，是可以在膳食干預(yù)中進(jìn)食的天然分子，能從可食用植物中分離出來(lái)，如新鮮蔬菜水果、豆類(lèi)。為此，檢測(cè)山楂酸在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化后的代謝產(chǎn)物，也有利于作為含PT成分植物的生物標(biāo)志物。

2.4.4 質(zhì)譜離子源比較

2.4.4.1 電子轟擊離子源(EI) Razbor?ek等[43]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-EI)對(duì)唇形科不同藥用植物迷迭香、山茱萸、丹參等提取物中三萜酸進(jìn)行了分離、鑒別和定量，研究主要集中在齊墩果酸、樺木酸和熊果酸，都可以通過(guò)氣相色譜的洗脫順序和質(zhì)譜中碎片離子信號(hào)的強(qiáng)度得以區(qū)分，其中主要觀察到質(zhì)譜裂解行為中diels-alder反應(yīng)。

2.4.4.2 大氣壓化學(xué)電離(APCI) Martelanc等[16]用HPLC-MS首次發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)出甘藍(lán)葉表蠟質(zhì)中3種三萜醇化合物：羽扇豆醇、ɑ-香樹(shù)脂醇、β-香樹(shù)脂醇。經(jīng)APCI電離后，質(zhì)譜圖上這3個(gè)同分異構(gòu)體給出了母離子峰及少量特征碎片離子峰的相對(duì)強(qiáng)度。因此，MS/MS質(zhì)譜應(yīng)用APCI離子源可以為色譜法分離的PT異構(gòu)體的母核鑒別提供可靠數(shù)據(jù)。

2.4.4.3 電噴霧電離源(ESI) Olmo-García等[44]用兩種不同電離源的探測(cè)器，對(duì)橄欖皮和樹(shù)葉提取物中PT次生植物代謝物進(jìn)行測(cè)定，包括：高二根醇、熊果醇、山楂酸、樺木酸、齊墩果酸和熊果酸。PT可以作為植物代謝保護(hù)劑，環(huán)繞在植物表面(葉、莖、花和果實(shí))，作為表皮蠟的一部分。研究使用ESI和APCI作為檢測(cè)系統(tǒng)的電離源對(duì)這些微量物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，并檢查這兩個(gè)電離源的結(jié)果吻合度。結(jié)果表明，ESI最低檢測(cè)極限：3～455 μg·L-1，其次為APCI：22～408 μg·L-1；ESI有最寬的動(dòng)態(tài)范圍，且這兩種探測(cè)器的定量結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.4.4 大氣壓光學(xué)電離源(APPI) Rhourrifrih等[45]用APPI和APCI研究了天然樹(shù)脂材料中PT類(lèi)化合物組成，因PT種類(lèi)多，其中還存在大量的同分異構(gòu)體。故用軟電離APPI可防止化合物碎裂后碎片多、信息雜，有助于化合物鑒定。并研究了3種摻雜劑：甲苯、丙酮和茴香醚對(duì)APPI-MS(包括：MS譜的靈敏度和定性離子)的影響。在選定的離子監(jiān)測(cè)條件下，線(xiàn)性范圍在0.005～0.015 mg·L-1內(nèi)定量測(cè)定，而APPI和APCI檢測(cè)范圍均為0.002～0.84 mg·L-1，范圍的廣度是由所研究PT的種類(lèi)決定的。結(jié)論是在正離子模式下，APPI比APCI更敏感，而APCI對(duì)酸性三萜的敏感性最高。

綜上幾個(gè)離子源的優(yōu)勢(shì)：EI、APCI、APPI、ESI除了提供分子質(zhì)量信息外，也提供了關(guān)于分子中功能基團(tuán)的存在的結(jié)構(gòu)信息；研究證明APCI與APPI相比，APCI特別適用于非極性小分子的電離；APPI特別適合于中性小分子的電離。缺陷：EI硬電離使PT碎裂后碎片多、信息雜，不利于識(shí)別；LC-ESI/MS方法目前只涉及酸性三萜類(lèi)化合物，而中性三萜類(lèi)化合物，則不能很容易被ESI離子化。

3 結(jié)論

近年來(lái)，PT類(lèi)功效成分研究已成為食品、藥品以及藥食同源產(chǎn)品研究的熱點(diǎn)。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷提高，色譜和波譜技術(shù)也越來(lái)越多地運(yùn)用到PT的分離分析中，各實(shí)驗(yàn)室采用不同的分析方法，如TLC-UV、GC-FID、GC-MS、HPLC-UV、HPLC-FLD、HPLC-MS、SFC-ELSD、SFC-UV、CZE-UV以及PGC-UV等對(duì)PT類(lèi)化合物進(jìn)行確證分析。其中氣相、薄層法、光譜法操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低；液相法、超臨界流體、質(zhì)譜法靈敏度高，但由于PT五環(huán)不易碎裂，不能形成定性碎片離子。隨著科技的發(fā)展，色譜和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)逐漸趨向成熟化，而質(zhì)譜聯(lián)用以及更換不同的電離源可以解決目標(biāo)物定性和定量問(wèn)題，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。PT類(lèi)功效成分的檢測(cè)對(duì)人體健康至關(guān)重要，在今后的研究過(guò)程中還應(yīng)不斷開(kāi)發(fā)新的色譜和波譜檢測(cè)法，以便盡可能快速、便捷檢測(cè)天然產(chǎn)物中PT成分，為今后充分開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)藥物及膳食添加產(chǎn)品發(fā)揮重要作用。