徐瑩

（澳諾（中國(guó)）制藥有限公司 河北保定 071000）

1 前言

菌種保藏作為藥品微生物檢驗(yàn)的重要內(nèi)容，技術(shù)人員在菌種保藏過(guò)程中，需要根據(jù)菌種的特性以及設(shè)備條件之間的差異合理地選擇菌種保藏方法，從而確保菌種的純度和活性滿(mǎn)足研究和藥品檢驗(yàn)的實(shí)際需求，為藥品微生物檢驗(yàn)工作的順利開(kāi)展提供保障。

2 菌種保藏的原理

微生物菌種保藏方法主要是應(yīng)用微生物的生理及生化特點(diǎn)之間的差異性，人為地創(chuàng)造缺氧、低溫、干燥條件，以降低微生物的新陳代謝，保證微生物的生命活動(dòng)處于停滯、休眠狀態(tài)，以保證停止生長(zhǎng)、繁殖的微生物中的遺傳物質(zhì)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性[1]。因此，微生物在這一狀態(tài)下能夠保持穩(wěn)定，進(jìn)而滿(mǎn)足維持種系的目標(biāo)?，F(xiàn)階段，菌種保藏方法主要有2種：（1）基質(zhì)中的低溫保藏方法。該方法主要有斜面保藏法、半固體穿刺保藏法、石蠟保藏法、沙土管保藏法等。其能夠應(yīng)用降低溫度、缺氧、減少養(yǎng)分供給的方式，減少微生物的新陳代謝，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保藏菌種的目標(biāo)。（2）保溫劑中的超低溫保藏，如真空干燥凍存法。這種方法主要是應(yīng)用保護(hù)劑的方式，減少溶液結(jié)晶，實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的有效平衡，更好地保存微生物，并將溫度降低到實(shí)際冰點(diǎn)位置，確保微生物的新陳代謝全部停止，這種方式操作具有一定的復(fù)雜性，但對(duì)硬件條件的要求比較高，能夠長(zhǎng)期保存菌種，具有較高的穩(wěn)定性。

3 藥品微生物檢驗(yàn)用菌種保藏方法

3.1 斜面低溫保藏法

斜面低溫保藏法是一種常用的保藏方法，這種方法的主要內(nèi)容是在操作過(guò)程中，將菌種培養(yǎng)到斜面培養(yǎng)基中，在菌種覆蓋整個(gè)斜面后，將菌種放置溫度為4℃的冰箱中進(jìn)行冷藏，一段時(shí)間后，使用相同的方式對(duì)菌種進(jìn)行轉(zhuǎn)培養(yǎng)，這種方式適用于多種菌種的短期保藏中，其具有操作簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、菌種存活率高等優(yōu)勢(shì)[2]。但是，這種方式的保存時(shí)間只能持續(xù)1～6個(gè)月，不適用于長(zhǎng)期保藏的菌種中，溫度需要控制在約4℃。通常情況下，菌種具有一定的代謝水平，能夠有效降低菌種的活性，但采用反復(fù)的菌種培養(yǎng)方式，會(huì)使得菌種出現(xiàn)變異問(wèn)題，進(jìn)而被感染。

3.2 石蠟油封藏法

石蠟油封藏法的主要原理是使用無(wú)菌處理和蒸發(fā)的方式去除培養(yǎng)成熟菌種斜面中的水分，然后使用石蠟封閉斜面，確保石蠟厚度高出培養(yǎng)斜面頂端約1 cm，這樣培養(yǎng)出的菌種能完全隔絕空氣。在封存完畢后，需要使用硅膠、固體石蠟等材料封住口部，將其垂直排放在溫度為4℃的冰箱中。這種方式的應(yīng)用不僅能滿(mǎn)足低溫、阻隔氧氣的作用，還可以降低培養(yǎng)菌種的活性，延長(zhǎng)菌種保存時(shí)間，適用于保存期在1～2年的菌種中。

3.3 冷凍真空干燥保藏法

冷凍真空干燥保藏法的原理是將包含菌種的懸液倒入保存瓶中，使其在低溫環(huán)境中快速凝凍，并放在低空狀態(tài)下抽成真空，使其中的水分升華，留下干燥的固體菌種，隨后將處理完的菌種保存在低溫環(huán)境中，使其處于休眠狀態(tài)，以便于長(zhǎng)期保存。冷凍真空干燥保藏法需要充分考慮低溫、干燥、阻斷氧氣等因素，其具有保存時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，能夠持續(xù)保存5～15年，且菌種不易變異，具有較高的存活率，適用于需要長(zhǎng)期保存的菌種，且無(wú)需占據(jù)很大的保藏空間。但是，這種方法的操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，需要引進(jìn)較先進(jìn)的技術(shù)、凍干機(jī)等設(shè)備。

3.4 定期移植法

定期移植法的主要原理是將菌種接種到適宜的環(huán)境中培養(yǎng)，避免因環(huán)境的改變導(dǎo)致菌種的遺傳物質(zhì)、形狀發(fā)生變化，在生長(zhǎng)充分后，保存在4～6℃的環(huán)境中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其保藏時(shí)間需要根據(jù)菌種、微生物的差異進(jìn)行選擇。定期移植法具有操作簡(jiǎn)便、便于提取等優(yōu)勢(shì)，往往需要移種進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，微生物和菌種會(huì)接觸外部環(huán)境，從而影響菌種的排異功能，且需要長(zhǎng)期保存，這種保藏方法需要投入大量的人力和資金，因而在實(shí)驗(yàn)需要、特殊要求的情況下，可以使用此方式。

3.5 沙土管保藏法

用吸鐵石去除河沙中的鐵質(zhì)，并浸泡在10%的鹽酸中，浸泡24 h后，將其清洗至中性，并進(jìn)行烘干備用，還要選取地表以下40～60 cm深度的非耕作、貧瘠的低黏性土，將其研碎過(guò)篩，清洗至中性，并進(jìn)行烘干備用。另外，將處理后的河沙和土質(zhì)按照2∶1的比例進(jìn)行混合，將其放入試管中，高度約1 cm，并使用棉塞進(jìn)行密封處理，隨后進(jìn)行濕熱滅菌，無(wú)菌檢驗(yàn)合格后可以使用。沙土管保藏法在檢驗(yàn)合格后密封保藏在4～6℃的冰箱中，每隔6個(gè)月驗(yàn)證一次，這種方法具有簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，用于產(chǎn)孢子和有芽孢的菌種保藏，可保存2年，但對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞不適用。除此之外，在真空干燥過(guò)程中，保藏放線(xiàn)菌和部分真菌的孢子時(shí)最好用干法接種。

3.6 液氮冷凍保藏法

首先，將菌種制作成懸液備用；其次，清洗并烘干安瓿瓶；最后，在安瓿瓶中裝入冷凍保護(hù)劑。在選擇保護(hù)劑的過(guò)程中，相關(guān)人員需要充分考慮被保藏微生物的類(lèi)別，每瓶需要注入10%～20%的甘油，并塞上棉塞，隨后放入高壓鍋中，在1.5 kg/cm2的壓力下滅菌30～45 min，檢查無(wú)菌后接入菌種，火焰熔封瓶口，并將封閉的安瓿瓶放入凍結(jié)器中，保證冷凍速度在1 min內(nèi)下降1℃，凍結(jié)到-35℃，將凍好的安瓿瓶放在-196～-150℃的液氮罐中進(jìn)行保藏，這種方法不僅適用于一般微生物的保藏，還適用于冷凍干燥法中無(wú)法保存的微生物，如支原體、衣原體等，這種方法的應(yīng)用不會(huì)改變菌種的形狀，但設(shè)備的價(jià)格比較高。

4 藥品微生物檢驗(yàn)用菌種保藏方法的特點(diǎn)

藥品微生物檢驗(yàn)用菌種保藏方法中常用的是斜面低溫保藏法，保存難度大、要求高的方法是冷凍真空干燥保藏法。在現(xiàn)代化社會(huì)的發(fā)展中，各個(gè)行業(yè)的技術(shù)水平在不斷提升，很多先進(jìn)設(shè)備融入菌種保藏的過(guò)程中，使菌種的保存期限越來(lái)越長(zhǎng)。但是，藥品微生物檢驗(yàn)用菌種保藏方法都具有自身的特點(diǎn)，相關(guān)人員需要根據(jù)菌種保藏目的的差異性，合理地選擇保藏方法。同時(shí)，由于各個(gè)菌種的特性存在一定的差異，在實(shí)際保藏過(guò)程中，技術(shù)人員需要在分析菌種特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，合理地選擇保藏方法。

5 結(jié)語(yǔ)

在選擇菌種保藏方法的過(guò)程中，相關(guān)技術(shù)人員需要充分了解菌種的相關(guān)內(nèi)容，合理地選擇保藏方法，確保菌種的活性和純度，充分發(fā)揮菌種在微生物實(shí)驗(yàn)中的作用。此外，在現(xiàn)代化的發(fā)展中，技術(shù)人員需要積極引進(jìn)先進(jìn)的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)，探索菌種保藏方法，將菌種保藏方法更好地應(yīng)用到藥品微生物檢驗(yàn)過(guò)程中，保證菌種具有原有的活性和純度，實(shí)現(xiàn)研究的準(zhǔn)確性、可靠性，為藥品微生物檢驗(yàn)工作的順利開(kāi)展提供保障。