張艷虎，周琢強(qiáng)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東廣州 510642）

茶樹的葉子在嫩綠的時候進(jìn)行加工就制成了茶葉，茶葉有多種多樣，且有很多品牌，通常有紅、綠、黑、花茶，飲茶具有明目清神的效果，對身體非常有益，有非常明顯的保健作用。茶葉含有大量嘌呤類生物堿，主要由咖啡因組成，一般含量都能達(dá)到2%～5%?？Х纫颍–AF）是一種弱堿性生物堿，脂溶性強(qiáng)，與強(qiáng)光以及高溫下不具有穩(wěn)定性，能夠溶在沸騰的水中、丙酮、乙酸乙酯、乙醇，非常容易溶解在二氯甲烷當(dāng)中。中樞神經(jīng)受到咖啡因刺激會變得非常興奮：達(dá)到增強(qiáng)大腦皮層興奮需要達(dá)到中低劑量（80～400 mg），降低疲勞，提神醒目，當(dāng)劑量達(dá)到（≥500 mg）就能夠使興奮延腦血管運(yùn)動中樞以及呼吸中樞，咖啡不僅能夠，在飲品、食品、日用化工等方面應(yīng)用，同時在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的運(yùn)用也非常廣泛。咖啡因的提取方式不僅可用有機(jī)合成法也可以用系統(tǒng)提取法。1820年，Runge第一次在可可豆和茶葉中取得，1950年中國在茶葉中取得；在1895年，F(xiàn)ischer運(yùn)用化學(xué)合成了咖啡因，1958年，中國合成之后進(jìn)行了生產(chǎn)。因?yàn)樗鼈冎g的晶型不一樣、精制方式也不一樣，所以，咖啡因粉的X-射線也不一樣。但升華可使合成品轉(zhuǎn)晶。運(yùn)用有機(jī)化學(xué)試驗(yàn)當(dāng)中溶劑法取得（索氏提取，濃度為95%的乙醇），在用升華法純化即可取得。檢測茶葉中咖啡因劑量的方法較多，例如容量分析法、薄層色譜法、氣相色譜法、紫外分光光度法、高效毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法等。此研究依據(jù)國標(biāo)GB/T 8312—2002中HPLC法對茶葉中咖啡因含量進(jìn)行檢測，在有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中用茶葉檢測含量，同時對同學(xué)們從茶葉里取得咖啡因的數(shù)據(jù)結(jié)果予以評價。

1 設(shè)備和化學(xué)試劑

1.1 設(shè)備

數(shù)字熔點(diǎn)測定儀（申光牌WRS-1A），電熱恒溫水浴鍋（型號：HWS-12），可調(diào)試電砂浴（型號：DK-2），精密電子天平（廠家：北京賽多利斯 型號：BSll0S），索氏提取器，紅外分光光度計（型號：島津IR-prestige-21），儀器高效液相色譜儀（雙波長紫外檢測器，島津LC-2010 AHT）。

1.2 試藥

咖啡因?qū)Ρ绕罚ㄗ约褐圃斓娜埸c(diǎn)測定儀進(jìn)行熔點(diǎn)測定234.27～235.67℃），甲醇（色譜純），茶葉（綠茶 1、紅茶和磚茶、綠茶 2、）（市場銷售），純凈水，乙醇（純度為95%）。

2 方式與效果

2.1 咖啡因的取得

稱量茶葉重量10g，放在研缽里予以研碎，然后放在索氏提取器里，用75 ml濃度為95%的乙醇獲取，放在水中進(jìn)行加熱，持續(xù)提取時間大概為1.5h，最后濃縮到20ml。加入化學(xué)試劑氧化鈣3～4g，之后用水蒸氣予以蒸干之后，將準(zhǔn)備好的玻璃漏斗倒放在蒸發(fā)皿之上，但中間必須用帶小孔的濾紙予以隔離，以防出現(xiàn)升華現(xiàn)象，然后加熱至200-230℃，升華進(jìn)行完以后，將其冷卻到100℃，將白色針狀結(jié)晶進(jìn)行收集，進(jìn)行稱量，最后測熔點(diǎn)。

2.2 咖啡因?qū)Ρ绕返闹苽?/h3>

取適量純度不高的咖啡因，置于蒸發(fā)皿當(dāng)中進(jìn)行更近一步的升華純化，測量其熔點(diǎn)，取適量咖啡因利用溴化鉀壓片測其紅外光譜。純化后的咖啡因熔點(diǎn)為234.27～235.67℃，和國家藥典文獻(xiàn)描述統(tǒng)一，數(shù)據(jù)庫對紅外光譜進(jìn)行檢索后與咖啡因圖譜統(tǒng)一。

2.3 咖啡因比例的檢測

2.3.1 色譜的條件

流速：1ml/min，檢測波長：280nm，柱溫：40℃，色譜柱：Inertsil ODS-SP柱（規(guī)格 4.6 mmX150 mm，5μm），進(jìn)樣量：10μm，流動相：水一甲醇（比例為 65：35）.

2.3.2 制備對照樣品溶液

準(zhǔn)確稱量12.5mg咖啡因?qū)φ諛悠?，放?5ml容量瓶內(nèi)，加乙醇一水（配比為 1：4）定容到刻度（500μg/m1），以備使用。

2.3.3 描畫制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

仔細(xì)吸取對比樣品液體（500/μg/m1）1.5、1.2、0.9、0.6、0.3ml，均放在10ml容量瓶當(dāng)中，然后加入純凈水到定容刻度，濃度分別為75、45、60、30、15μg/ml對比樣品溶液，然后用0.45μm微孔濾膜進(jìn)行過濾。根據(jù)以上色譜要求進(jìn)樣10μl，縱坐標(biāo)用峰面積A表示，橫坐標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)咖啡因濃度C，進(jìn)行描繪制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要濃度在15～75μg/ml內(nèi)，咖啡因和峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)y=O.9999，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=24137C+35952.

2.3.4 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量8份（每份2.0g）茶葉（綠茶1）樣品，在當(dāng)中的6份里各放進(jìn)兩份高（45mg）、中（25mg）、低（10 mg）3種不一樣劑量的對比樣品，其中的2份作為本底值，根據(jù)樣品溶液取得辦法制備并且加入標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，根據(jù)樣本的檢測方法予以檢測?；厥章实挠嬎憬Y(jié)果是91.90%-100.03%。

2.3.5 精確度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取0.9ml對照品溶液，放在10ml容量瓶當(dāng)中，然后加水進(jìn)行稀釋直到規(guī)定刻度，濃度是45μl/ml，兩小時進(jìn)一次樣，共需要測量五次。每天精密度計算結(jié)果為0.042%。

2.3.6 樣本測量和對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱量四種茶葉的重量各10g，然后放在研缽里予以研碎，再將其放入索氏提取器當(dāng)中，在其中加入濃度為95%的乙醇75 ml，放在95℃水中進(jìn)行加熱，提取時間需要持續(xù)大概1.5h，濃縮以后放在100ml容量瓶里加水定容，準(zhǔn)確吸取1.0ml，用水定容至刻度在5ml的棕色量瓶中，0.45μm微孔濾膜進(jìn)行過濾然后進(jìn)樣，最后測定結(jié)果。

3 探討

同學(xué)們進(jìn)行的試驗(yàn)當(dāng)中提取率最高的分別是紅茶、綠茶2，最低的是磚茶，HPLC檢測結(jié)果與其統(tǒng)一。不過收率都不高，通過研究發(fā)現(xiàn)造成收率低的因數(shù)有兩個。第一是因?yàn)橥瑢W(xué)們試驗(yàn)時在升華時沒有將溫度控制好，結(jié)晶不能全部予以收集；第二是磚茶研磨的不夠到位，因?yàn)榇u茶的枝葉比較硬，也是導(dǎo)致提取率偏低的因素；最后在1.5提取時虹吸次數(shù)的不穩(wěn)定也會造成提取率不高。同學(xué)們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和HPLC結(jié)果進(jìn)行對比，兩者的提取率都大于10%，紅外光譜檢測與收集在一起的咖啡因通過熔點(diǎn)檢測獲得的產(chǎn)物純度比較高，證明咖啡因通過有機(jī)溶劑在茶葉中提取的辦法比較成熟。

此研究依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8312—2002當(dāng)中利用HPLC法檢測茶葉中所含咖啡劑量的方法，根據(jù)國準(zhǔn)給出的色譜要求，流動相：水-甲醇（配比為 70：30），柱溫：40℃，流速：1ml/min，進(jìn)樣量：10μl，檢測波長：280nm，測得結(jié)果是其它物質(zhì)峰比較多的存在于綠茶2、綠茶1當(dāng)中，很難完全和咖啡因峰區(qū)別開，依據(jù)高效液相色譜道理將流動相極性增大，通過數(shù)次試驗(yàn)把流動相改成：水-甲醇（比例為65：35），其他條件不做改變，從而將咖啡因峰和其他物質(zhì)峰進(jìn)行分離在從4種茶葉里獲取樣品溶液的過程當(dāng)中。在測定HPLC時，綠茶2、綠茶1都含有比較多的其它物質(zhì)峰，但紅茶與磚茶就比較少。依據(jù)調(diào)查研究得出因?yàn)楣に囈约霸系牟町悓?dǎo)致茶葉中成分存在不一樣的地方。茶樹新梢作為綠茶的原材料，通過反復(fù)搓擦、殺青（經(jīng)過高溫予以破壞以及對新鮮葉子當(dāng)中的氧化酶活性進(jìn)行鈍化）、使茶葉失去水分等工藝制做而成，由于通過氧化酶滅活以后，茶葉的很多成分能夠保留在炮制過程當(dāng)中，會產(chǎn)生紫外吸收當(dāng)在280nm的紫外檢測波長之下，會出現(xiàn)很多物質(zhì)峰。茶樹上面的新芽葉作為紅茶的原材料，通過發(fā)酵干燥等制作而形成，讓茶葉在炮制時全面氧化分解代謝，降低了產(chǎn)生的紫外吸收在280nm紫外檢測波長之下，就會表現(xiàn)出相對偏低的物質(zhì)峰。