楊一嫻 李昌盛 王蓓蕾 黨素英

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)系，上海 200025

杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）是一種全身肌肉呈漸進(jìn)性損傷和運動功能減退的致死性X 連鎖隱性遺傳病?；純憾嘤?～4歲出現(xiàn)步態(tài)異常，10～12歲逐漸喪失行走能力，最終在20～30歲死于心肺功能衰竭。男嬰發(fā)病率為1/3500，我國每年有400～500例DMD 男嬰出生，累計患者7萬～8萬人，是世界上該病患者人數(shù)最多的國家之一。該病發(fā)病原因是位于Xp21.2-p21.1的編碼抗肌萎縮蛋白（Dystrophin）的DMD 基因突變，導(dǎo)致Dystrophin 蛋白在肌細(xì)胞膜上缺失，患者肌細(xì)胞變性、壞死繼而脂肪結(jié)締組織增生。DMD 基因突變類型有多種，大片段缺失占60%～65%，大片段重復(fù)占5%～10%，點突變、小片段缺失和重復(fù)占25%～30%。雖然目前尚無非常有效的治療方法，但隨著對DMD 的發(fā)病機制和病理變化過程愈漸深入的認(rèn)識，對其治療的研究與相關(guān)臨床試驗有了很多新的突破。本文對DMD 近年來相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下：

1 治療方法

1.1 對癥治療藥物

Dystrophin 蛋白缺失會導(dǎo)致一系列病理變化，包括肌肉萎縮、炎癥、鈣過載、氧化壓力、組織缺血等。針對這些病理變化過程的相關(guān)藥物治療可以使所有患者獲益。

1.1.1 激素 激素是目前認(rèn)為能夠減慢DMD 患者肌力和運動功能衰退的唯一藥物，長期每日服用糖皮質(zhì)激素能明顯延緩患者病情進(jìn)展。它的作用機制主要是通過抑制NF-κB 通路抑制炎癥，激活鈣調(diào)磷酸酶NFAT通路抑制肌壞死。目前強的松和強的松龍是最常用的激素治療藥物，美國FDA 批準(zhǔn)的地夫可特也可以用于DMD，且副作用更小[1]。近年來正在研發(fā)溫和激素Vamorolone（VBP15），相對于傳統(tǒng)激素，能以更小的副作用獲得同等療效[2]。

1.1.2 其他針對NF-κB 的藥物 脂聯(lián)素和NEMO 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）的小分子模擬物可以降低NF-κB 的活性（已在DMD 疾病小鼠mdx 小鼠和肌營養(yǎng)不良癥金毛獵犬中表現(xiàn)出更好的治療效果），減少炎癥，促進(jìn)肌肉再生，有望成為治療DMD 新的方法[3]。Edasalonexent（CAT-1004）也是NF-κB 核因子抑制劑，二期臨床實驗結(jié)果顯示，服用該藥物的DMD 患者運動功能得到一定改善，且未發(fā)現(xiàn)安全問題[4]。目前該藥物正在進(jìn)行三期臨床實驗。

1.1.3 調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞中鈣水平的藥物 DMD 的病理特征之一是鈣調(diào)節(jié)異常而造成肌肉損害，因此調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞中鈣含量能夠減緩DMD 疾病的發(fā)展。Poloxamer188 NF 能封閉肌肉纖維損害后留下的微孔，阻止鈣滲透，有效改善橫膈膜的功能，改善呼吸功能[5]，該藥物目前正在進(jìn)行二期臨床實驗。Omega3能夠顯著降低心臟和肌肉中總鈣水平，對DMD 疾病晚期患者有一定的緩解作用[6]。另外，AT-300通過阻斷鈣通道[7]，BGP-15促進(jìn)肌質(zhì)網(wǎng)膜鈣ATP 酶（SERCA）功能都能調(diào)節(jié)細(xì)胞中鈣含量[8]，減緩DMD 疾病的進(jìn)展。

1.1.4 促進(jìn)肌肉生長 Myostain 蛋白能夠限制人體肌肉過度生長，因此抑制這種蛋白表達(dá)可以增加肌肉生長，起到治療作用。BMS-986089、Domagrozumab 都是正在開展相關(guān)臨床實驗的Myostain 蛋白抑制劑，到目前為止，患者耐受性較好[9]。組蛋白脫乙酰酶能通過改變細(xì)胞內(nèi)DNA 的三維折疊影響基因的表達(dá)活性，影響肌肉細(xì)胞再生能力和收縮功能，也會促發(fā)炎癥。DMD 患者中該酶水平高于正常人，因此抑制該酶的藥物Givinostat 可以促進(jìn)患者肌肉生長，目前該藥物已進(jìn)入三期臨床實驗[10]。utrophin 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能與抗肌萎縮蛋白相類似，出生后會被抗肌萎縮蛋白代替，只保留在神經(jīng)肌肉接頭處。Ezutromid 能夠增加utrophin蛋白的表達(dá)，彌補患者肌肉中抗肌萎縮蛋白的不足，達(dá)到治療目的。二期臨床實驗結(jié)果已顯示該治療方法的價值[11]。

1.1.5 抗纖維化 DMD 患者體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β通常過表達(dá)，且TGF-β 水平與患者的肌肉組織纖維化程度相關(guān)，因此抑制TGF-β 可以減少肌肉纖維化，減輕DMD 癥狀。常山酮是TGF-β 信號通路下游Smad3磷酸化的抑制劑，能增強肌肉中衛(wèi)星細(xì)胞的活性及肌細(xì)胞的存活，減輕患者肌肉組織的纖維化和炎癥，目前HT-100（緩釋常山酮）正在進(jìn)行臨床試驗[12]。小分子酪氨酸激酶抑制劑Nintedanib 能降低成纖維細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，減少纖維化基因如COL1A1、COL3A1、FN1、TGFB1和PDGFA 的表達(dá)。研究中Nintedanib 減弱了mdx 小鼠骨骼肌的纖維化并誘導(dǎo)功能性肌肉改善，顯示出其成為DMD 藥物的潛能[13]。

1.1.6 針對無義突變的通讀療法 約15%的DMD 患者是由于點突變導(dǎo)致了終止密碼提前出現(xiàn)使mRNA翻譯提前終止，不能產(chǎn)生完整的蛋白。PTC 制藥公司研發(fā)生產(chǎn)的Ataluren（Translarna）可以與核糖體結(jié)合，使其翻譯含提前終止密碼子mRNA，從而能表達(dá)完整蛋白質(zhì)。該藥已在2014年獲得歐洲醫(yī)藥管理局條件性批準(zhǔn)用于5歲以上有行走能力的無義突變DMD 患兒，近年來進(jìn)一步被批準(zhǔn)用于2～5歲無義突變DMD患兒[14]。關(guān)于其使用范圍的臨床研究正在進(jìn)行。

1.2 物理治療

適量的運動訓(xùn)練以及應(yīng)用矯形支具可以刺激DMD 患者肌肉蛋白質(zhì)的合成，延緩呼吸衰竭，防止關(guān)節(jié)攣縮。近年來有研發(fā)虛擬現(xiàn)實（VR）游戲訓(xùn)練方案以增加訓(xùn)練的趣味性，也有研發(fā)供DMD 患者使用的機器人上肢外骨骼，是使DMD 患者能夠繼續(xù)使用手臂功能的可移動設(shè)備。

1.3 基因治療

1.3.1 基因替代療法 基因替代療法是指在DMD 患者基因組中插入外源的DMD 基因，表達(dá)出有功能的Dystrophin 蛋白，以緩解患者癥狀的方法。由于DMD基因大，受腺相關(guān)病毒（常用的基因載體）裝載容量的限制，一般采用截短的微型DMD 基因microdystrophin。研究者對DMD 實驗狗進(jìn)行microdystrophin 基因治療后，實驗狗肌肉退化速度降低，且沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用[15]。美國現(xiàn)已開展微型DMD 基因治療的一期和二期a 的臨床實驗。因microdystrophin 不能發(fā)揮全長Dystrophin 的功能，研究者也在研究如何擴大基因載體的容量。雙腺相關(guān)病毒基因載體技術(shù)[16]和慢病毒載體可能用來裝載全長的DMD 基因[17]。

1.3.2 外顯子跳躍法 針對移碼突變導(dǎo)致的DMD 疾病，利用反義核苷酸與pre-RNA 雜交，誘導(dǎo)切除特定的外顯子，能使移碼突變的mRNA 閱讀框恢復(fù)，可編碼產(chǎn)生截短的Dystrophin 蛋白，恢復(fù)其部分功能。FDA在2016年批準(zhǔn)的eteplirsen 是一種能夠跳躍51號外顯子的反義核苷酸，適用于大約13%的DMD 患者治療。使用etepliesen 長期治療能促進(jìn)有功能的Dystrophin 蛋白表達(dá)[18]，延緩患者呼吸功能的下降[19]，但eteplirsen 療效需進(jìn)一步確認(rèn)和改善。目前已開發(fā)出新一代跳躍51號外顯子治療藥物，新加入的細(xì)胞滲透肽能夠提高藥物滲透入細(xì)胞的能力，從而提高治療效果[20]，另一新開發(fā)出的51號外顯子跳躍藥物WVE-210201早期研究數(shù)據(jù)顯示效果強于eteplirsen[21]，兩者都處于一期臨床實驗階段。53號和45號外顯子跳躍藥物golodirsen 和casimersen 也在進(jìn)行臨床實驗。實驗發(fā)現(xiàn)治療后患者抗肌萎縮蛋白有明顯增加[22]。

1.3.3 基因編輯 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯既可通過引入小的插入或缺失使移碼突變的DMD 基因恢復(fù)編碼框（reframing），又能誘導(dǎo)外顯子跳躍，還能通過基因重組糾正無義突變等。利用基因編輯的方法，去除mdx 實驗鼠突變的21～23外顯子，恢復(fù)DMD基因編碼框，實驗鼠Dystrophin 蛋白的表達(dá)增加，心肌的功能有所恢復(fù)[23-24]。對缺失DMD 基因50外顯子的實驗鼠進(jìn)行基因編輯實現(xiàn)reframing 或跳躍51號外顯子，同樣顯示了良好的治療效果[25]。目前遞送基因編輯組件一般采用病毒載體，存在有效率低及安全性差等問題。研究者設(shè)計了一種新的遞送方法CRISPR-Gold，用金納米粒子裝載基因編輯組件進(jìn)入細(xì)胞。實驗中對mdx 小鼠肌肉細(xì)胞注射，與對照組相比抗肌萎縮蛋白修復(fù)增多，肌肉力量增強[26]。

1.4 干細(xì)胞療法

干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制能力并且可以分化成多種功能細(xì)胞的多潛能細(xì)胞。干細(xì)胞療法是將自體或同種異體干細(xì)胞移植到DMD 患者體內(nèi)，使其分化成肌細(xì)胞并表達(dá)肌萎縮蛋白，從而治療患者。

心肌損害是患者死亡的其中一個非常重要的原因，因此正在研究一種心肌干細(xì)胞療法CAP-1002，獲取健康供體的心臟組織進(jìn)行培養(yǎng)后注入患者的冠狀動脈至心臟，目前正在進(jìn)行的一期、二期臨床實驗顯示了該方法的安全性，并且患者的心臟和手臂功能得到明顯改善[27]。除此之外，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、肌源性干細(xì)胞（MDSCs）都有其對DMD 進(jìn)行干細(xì)胞移植治療的潛力。但多數(shù)干細(xì)胞移植還存在同種異體免疫反應(yīng)、低存活率、移植量限制及形成腫瘤的潛在風(fēng)險等問題。研究者開發(fā)了嵌合細(xì)胞療法，將正常供體的細(xì)胞和患者細(xì)胞融合后制備嵌合細(xì)胞，再移植進(jìn)mdx 小鼠中，結(jié)果顯示小鼠肌肉力量和功能顯著改善，且因為帶有自體細(xì)胞，相對副作用少[28]。

干細(xì)胞療法還可以與基因治療相結(jié)合，對來自DMD 患者的干細(xì)胞進(jìn)行基因修復(fù)，基因修復(fù)后的干細(xì)胞在實驗室中培養(yǎng)分化為肌肉細(xì)胞，再將這些肌肉細(xì)胞注射進(jìn)mdx 小鼠體內(nèi)，結(jié)果小鼠產(chǎn)生了健康的肌肉纖維和肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，肌肉功能也有明顯的改善。使用改造后的干細(xì)胞治療mdx 小鼠，小鼠更短時間內(nèi)就生長出健康的肌肉纖維[29]。

2 展望

針對DMD，有很多治療方法目前正在研究中。其中基因治療DMD 的研究在近年來取得了較大進(jìn)展，包括治療手段的多樣化及遞送載體的不斷改進(jìn)，但基因治療中很多潛在隱患也需要進(jìn)一步解決。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞和基因治療相結(jié)合的療法展現(xiàn)出了良好的前景。對癥治療的方法，由于其不像基因治療對患者突變類型有要求，可造福所有患者，容易快速地進(jìn)入臨床實驗，也是不可忽視的研究方向。物理治療方法相對來說只能延緩患者病情，但其能夠延長患者壽命，提高患者生存質(zhì)量，值得推廣和發(fā)展。目前，眾多的治療方法對動物模型包括mdx 小鼠及GRMD 金毛狗都已經(jīng)展現(xiàn)出較好的治療效果，但是在人類身上還需要進(jìn)一步臨床實驗驗證，以確保藥物的有效性和安全性，避免出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。相信目前仍無藥可治的DMD 在不久的將來會在研究者們共同的努力下最終被攻破。