皺紋、皮膚下垂以及色斑等是皮膚老化過程中常見的外觀改變，同時還可能伴隨一些不適感，例如對刺激物敏感性增強或重度干燥癥增多等，這些不適感的出現(xiàn)可能跟表皮屏障的滲透性和表皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)的變化有關。實際上，不同年齡人群的角質(zhì)層厚度都在正常范圍且屏障功能也差異甚微，但年長者皮膚出現(xiàn)慢性干燥癥的概率卻較高，同時其經(jīng)表皮失水量（TEWL）也會增大。這可能與老化角質(zhì)層內(nèi)細胞間脂質(zhì)成分的改變和總脂質(zhì)量的減少有關，因為角質(zhì)層組分的變化會直接影響屏障功能的物理化學特性。

到目前為止，大多數(shù)報道的臨床研究都基于TEWL測量來分析表皮屏障功能或檢測受損后表皮恢復到正常的內(nèi)穩(wěn)態(tài)情況。但TEWL僅能為屏障恢復動力學提供一個宏觀的視圖，無法從微觀的分子水平來洞悉屏障恢復過程。因此我們在TEWL的基礎上，增加轉(zhuǎn)錄分析法來描述不同的皮膚生理損傷或美容處理對人表皮屏障功能的影響，還通過微陣列分析來按時間順序確定表皮恢復過程中所發(fā)生的主要分子變化，了解多種生物學功能。該研究旨在比較年長和年輕志愿者在人為除去角質(zhì)層后表皮屏障功能恢復動力學的特征，希望能通過確定可重復的重要標記物來反映年齡對屏障功能的影響。

一、材料和方法

研究招募30名（67±4）歲健康白種人男性志愿者作為年長組，皮膚光反應類型Ⅱ-Ⅲ型。年輕對照組來自之前一個相似的研究，由30名（27±4）歲的志愿者組成。使用膠帶剝脫法對這兩組志愿者一側前臂屈側皮膚連續(xù)貼撕，直至皮膚發(fā)光即完成角質(zhì)層移除。年長組、年輕組分別需要（48±7）、（45±8）次操作來達到預期，每名志愿者對側前臂屈側皮膚作為對照。隨后對雙前臂皮膚進行局部麻醉，分別獲得剝脫處和對側皮膚組織活檢標本（1.5 cm×1.5 cm）。將兩組志愿者（各30人）再隨機分成5個亞組（每6人1組），每個亞組對應1個取樣時間，分別在初次取樣后的2、6、18、30和72 h再次進行雙臂取樣，記錄屏障恢復隨時間變化的數(shù)據(jù)。具體分析方法和數(shù)據(jù)處理請參考原文。

二、結果

1.屏障功能恢復動力學：反復剝脫處理去除角質(zhì)層會引起即刻TEWL急劇增加。隨著時間推移，水分流失量會逐漸恢復正常。對比年長和年輕兩組志愿者皮膚剝脫處理后每個時間點的屏障功能恢復率發(fā)現(xiàn)：在整個動力學過程中，年輕組的恢復非常顯著（P=0.001 1），而年長組前30 h的恢復都不明顯。雖然兩組在72 h的恢復情況相似，但年輕組的屏障恢復速度明顯快于年長組。

2.年輕與年長組表皮內(nèi)基因調(diào)控情況：膠帶剝脫操作后的一段時間內(nèi)，年長組表皮細胞內(nèi)有382個基因表達發(fā)生顯著變化，年輕組則為370個。兩組中有184個基因都被調(diào)節(jié)，另外還有198個基因和186個基因分別在年長和年輕組中發(fā)生調(diào)控。因此，兩組的特征差異主要來自這198和186個基因的調(diào)控情況。

3.年輕和年長組表皮修復過程中基因表達的動力學：每個時間點記錄6名志愿者，5個時間點分別會得到370個（年輕組）和382個（年長組）受調(diào)基因的30個子集合。通過無監(jiān)督學習的層次聚類法，對這些受調(diào)基因?qū)恼麄€折疊變化值進行收集和分類，目的是不帶任何前提地分析出數(shù)據(jù)。研究目的之一是跟蹤兩組志愿者基因表達情況隨時間的變化。結果發(fā)現(xiàn)，不同年齡組間基因表達動力學存在差異。年輕組在6 h和年長組在30 h都清晰地出現(xiàn)了基因表達最強烈的變化。在年輕組表皮中，受調(diào)基因數(shù)量從2 h的52個急劇增加至6 h的266個，而18 h又逐漸減少到122個，30 h繼續(xù)降至104個，72 h降至8個。在年長組表皮中，受調(diào)基因的數(shù)量是從2 h的32個增加至6 h的145個，再到18 h的112個，30 h增加至286個，而72 h降至27個。

4.受調(diào)基因的功能分析：年長組和年輕組受調(diào)基因所致的分子功能無明顯差異，每個功能家族受調(diào)基因的數(shù)量也基本相同。主要的差別是參與屏障修復過程的每個生物學功能發(fā)生的時間，總體來看年長組要晚于年輕組。參與細胞周期、細胞生長和增殖及參與DNA、RNA和蛋白加工家族的基因是兩個典型的例子。這些基因隨時間呈鐘型曲線變化，年輕組在6 h達到峰值，而年長組則在30 h達到峰值。

5.年長組和年輕組表皮受調(diào)基因的總體比較：在兩組中挑選出表達會隨時間變化的184個基因，通過雙向方差分析法來比較兩組基因，確定基因表達隨時間和年齡的顯著性改變，分析年齡對基因調(diào)控發(fā)生時間的影響。發(fā)現(xiàn)有8個基因的表達隨年齡或年齡/時間相互作用而分別呈顯著性差異?？赡苁且驗椴煌挲g供體的基因受調(diào)強度有差異（如基因SPPR1B），也可能是基因受調(diào)控的動力學不同（如基因KRT6B）。這8個基因主要都參與角質(zhì)形成細胞的分化。

此外，186個基因僅在年輕組內(nèi)發(fā)生調(diào)控，198個基因僅在年長組內(nèi)發(fā)生調(diào)控。這兩組基因應該能夠說明在表皮修復過程中與年齡相關的特異性變化。接著又挑選了這些年齡特異性受調(diào)基因的核心群體，同時挑選6 h和30 h作為比較時間點，因為這兩組大部分的基因是在這兩個時間點發(fā)生調(diào)控。分析后發(fā)現(xiàn)這些基因即是在表皮修復過程中與年齡相關特異性最可靠也最具代表性的基因群體。年輕組受調(diào)基因主要參與DNA、RNA管理及蛋白質(zhì)加工，年長組的受調(diào)基因則主要參與細胞通訊、解毒和氧化應激的管理。

三、討論

之前，我們分析了年輕志愿者在角質(zhì)層移除后2～72 h內(nèi)表皮屏障功能隨時間的恢復情況。在該研究中我們追加了年長志愿者的相關數(shù)據(jù)，并對兩組結果進行對比分析，以了解皮膚老化在表皮屏障功能恢復過程中的作用。首先，TEWL測量結果發(fā)現(xiàn)，相比年輕組，年長組表皮屏障功能恢復相對延遲，即整個72 h內(nèi)，年輕組的TEWL動力曲線變化十分明顯，而年長組則是到30 h才出現(xiàn)顯著變化。分析兩組樣本不同時間點的受調(diào)基因情況進一步證實了該結論。對于年輕組，基因受調(diào)率峰值出現(xiàn)在角質(zhì)層移除后6 h，而年長組則推遲出現(xiàn)在30 h?？梢娫谀贻p組表皮中，與修復過程相關的細胞活動會更早發(fā)生。其次，還發(fā)現(xiàn)不同年齡段的受調(diào)基因差別巨大。兩組均有約400個基因發(fā)生調(diào)控，相似的基因僅為184個，另外還有198個（年長組）和186個（年輕組）基因完全不同。盡管如此，這些基因總體的生物學功能還是比較相似。不同的是，年輕組中大部分基因的調(diào)控發(fā)生在角質(zhì)層移除后6 h，而年長組則發(fā)生在30 h。同時一些與剝脫相關的分子功能在年長表皮內(nèi)也會延遲發(fā)生，這些功能包括細胞黏附、氧化應激管理、細胞基質(zhì)組成、介導胞內(nèi)和胞間信號的加工、細胞生長和增殖、DNA或RNA加工/合成及修復。最后，盡管參與兩組表皮屏障恢復的總體生物學功能在根本上是相似的，但仍有3組基因的表達表現(xiàn)出明確的年齡依賴性差異。該結果強烈提示，年長組表皮延遲的屏障修復過程是由基因應答的總體滯后所導致的。這些滯后應答的基因包括細胞信號、DNA轉(zhuǎn)錄、RNA翻譯以及一些參與表皮分化過程中屏障修復的重要基因。例如年長組表皮內(nèi)KRT6B基因調(diào)控明顯延遲。KRT6B基因會在角質(zhì)形成細胞內(nèi)受過度增殖刺激（如傷口愈合、銀屑病以及一些其他炎癥性疾病等）的強烈誘導。年長組該基因的延遲誘導會導致老化的角質(zhì)形成細胞對剝脫性損傷出現(xiàn)延遲適應。另外，SPPR1B基因（角質(zhì)蛋白）在年輕組表皮內(nèi)顯著上調(diào)，而在年長組表皮內(nèi)則變化幅度較弱。此基因?qū)幋a的角質(zhì)蛋白能夠在屏障受損的時候緊急提供表皮的骨架結構，年長表皮中該基因的低誘導可能反映了較差的表皮屏障恢復能力。研究還發(fā)現(xiàn)一些涉及線粒體電子傳遞機制的基因在兩組間的差異（年長組中上調(diào)），表明老化的表皮修復需要更多能量。

綜上，我們在本研究中明確了年輕和年長者表皮修復的特異性轉(zhuǎn)錄標記，為描述表皮修復情況和內(nèi)穩(wěn)態(tài)提供了新方法。另外，相比TEWL檢測法，轉(zhuǎn)錄學分析對比較年齡對屏障功能的影響會更加敏感。然而該臨床研究還需要更多的皮膚活檢數(shù)據(jù)，但這會涉及到一些倫理問題。無論如何，了解正常表皮和維持表皮完整的機制至關重要，有助于發(fā)現(xiàn)促進表皮修復和改善表皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)的新對策。