劉洋 徐宇 張芙蓉 譚燦 楊國玲

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科 116011

犬小孢子菌可引起人畜共患的皮膚癬菌病，是我國兒童頭癬的常見病原菌。本課題組前期已通過抑制消減雜交技術(shù)（SSH）成功構(gòu)建犬小孢子菌差異基因文庫［1］，篩選出頭皮誘導(dǎo)培養(yǎng)下呈差異表達(dá)的4條基因，其中PQ-LRP基因在頭皮誘導(dǎo)培養(yǎng)下較光滑皮膚呈現(xiàn)高表達(dá)［2］。我們通過cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)完成PQ-LRP基因全長cDNA序列的擴(kuò)增和測序［3］，利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建犬小孢子菌PQ-LRP干擾株［4］，發(fā)現(xiàn)PQ-LRP基因干擾株較野生株生長受限，不易感染宿主，毒力減弱，推測PQ-LRP基因可能是犬小孢子菌致病毒力因子之一［5］。為研究PQ-LRP在犬小孢子菌中的定位，我們將PQ-LRP基因片段連接至增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的上游后在犬小孢子菌中表達(dá)，并對融合EGFP在細(xì)胞中的定位進(jìn)行初步研究，為后期探討該基因在頭癬發(fā)病機(jī)制中的作用提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

犬小孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株（ACTT10394）為大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科真菌室保存菌種，經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)及轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列PCR擴(kuò)增后電泳鑒定為犬小孢子菌。TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒、TaKaRa Tks Gflex DNA聚合酶、TaKaRa MiniBEST瓊脂糖DNA提取試劑盒均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；根癌農(nóng)桿菌EHA105電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞、Premix TaqTM、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞、Tks Gflex?DNA聚合酶、In-Fusion?HD Cloning試劑盒均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；潮霉素產(chǎn)自Sigma-Aldrich（中國）公司；Trizol試劑盒為賽默飛世爾（中國）科技有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pEGFP-N1、pSilent-1、pCAMBIA1300為武漢淼靈科技有限公司產(chǎn)品。

二、方法

1.犬小孢子菌總RNA提?。簠⒄誘rizol試劑盒說明書提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定A260/A280比值，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA片段大小。

2.融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：①將自犬小孢子菌中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；②以上述cDNA為模板，引物見表1，PCR擴(kuò)增PQ-LRP基因，兩端添加酶切位點(diǎn)SacⅠ/BamHⅠ，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，98℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；③將pEGFPN1質(zhì)粒用SacⅠ/BamHⅠ雙酶切（37℃2 h），將酶切后純化回收的pEGFP-N1載體與PQ-LRP基因片段連接（50℃15 min）得到pEGFP-LRP載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（E.coli）JM109中，提取質(zhì)粒測序驗(yàn)證；④以pSilent-1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增真菌通用啟動子（Ptrpc）和真菌通用終止子（Ttrpc）序列，引物見表1；以pEGFP-LRP載體為模板，PCR擴(kuò)增LRP-EGFP基因序列，擴(kuò)增引物見表1，反應(yīng)條件：98℃變性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；⑤SacⅠ/HimdⅢ雙酶切pCAMBIA 1300質(zhì)粒（37℃4 h），將酶切后純化回收的pCAMBIA 1300載體與上述④中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接（50℃15 min），得到表達(dá)載體。將上述重組的表達(dá)載體pCAMBIA-LRP-EGFP轉(zhuǎn)化到E.coliJM109中，挑取單菌落，提取質(zhì)粒送至寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。用電轉(zhuǎn)化方法將表達(dá)載體從E.coliJM109供體菌中轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA 105中，對陽性克隆用M13-47、RV-M引物（表1）進(jìn)行PCR鑒定。

表1 構(gòu)建pCAMBIA-LRP-EGFP表達(dá)載體所用引物

3.犬小孢子菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選：取1 ml吸光度A600為0.6～0.8的轉(zhuǎn)化后根癌農(nóng)桿菌與1 ml 5×105個(gè)/ml的犬小孢子菌分段菌絲混合，將200 μl混合液涂布于添加乙酰丁香酮（AS 200 μmol/L）的誘導(dǎo)平板上，25℃避光培養(yǎng)24、36、48、60、72 h，將共培養(yǎng)的含有根癌農(nóng)桿菌和犬小孢子菌分段菌絲的混合物轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)平板上（含300 mg/L潮霉素、200 μmol/L頭孢噻肟鈉），25℃培養(yǎng)14 d直至菌落出現(xiàn)［4，6］。將犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子在無潮霉素的沙氏培養(yǎng)基上傳代5次后，接種至含有潮霉素（300 mg/L）和頭孢噻肟鈉（200 μmol/L）的誘導(dǎo)平板上，檢測轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性，提取上述轉(zhuǎn)化子基因組DNA，PCR擴(kuò)增融合基因LRP-EGFP進(jìn)行驗(yàn)證。

4.菌絲處理及LRP-EGFP融合蛋白定位：將帶有融合質(zhì)粒的犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子在沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后，取菌絲用PBS（pH7.4）沖洗2次，用0.5 mol/L山梨醇溶液處理后置于載玻片上用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

結(jié)果

一、融合基因表達(dá)載體的鑒定

1.pEGFP-LRP質(zhì)粒PCR鑒定：用引物L(fēng)RP-EGFP-F、LRP-EGFP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見約1 800 bp的目的片段，證明目的片段連接到pEGFP-N1載體中，得到載體pEGFP-LRP（圖1），經(jīng)測序驗(yàn)證為目標(biāo)序列。

2.Ttrpc、Ptrpc的PCR擴(kuò)增：對Ptrpc與Ttrpc基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，分別可見約1 300 bp與780 bp左右的片段，與Ptrpc及Ttrpc基因片段相符。見圖1。

3.表達(dá)載體pCAMBIA-LRP-EGFP測序驗(yàn)證：驗(yàn)證結(jié)果顯示，PQ-LRP與EGFP基因片段蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）區(qū)無突變。

二、pCAMBIA-LRP-EGFP質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化結(jié)果

將pCAMBIA-LRP-EGFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，PCR鑒定顯示約4 000 pb的片段（圖2），證明載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中。

三、犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

圖1 LRP-EGFP、Ttrpc、Ptrpc基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：Ptrpc（1 340 bp）；2：LRP-EGFP（1 838 bp）；3：Ttrpc（786 bp）圖2轉(zhuǎn)染pCAMBIA-LRP-EGFP質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：pCAMBIA-LRP-EGFP質(zhì)粒

圖3 犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子DNA電泳圖M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA圖4犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子融合基因LRP-EGFP的PCR檢測M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：轉(zhuǎn)化子LRP-EGFP

瓊脂糖凝膠電泳顯示，犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA條帶比較透明清晰，無拖帶現(xiàn)象（圖3），紫外分光光度計(jì)檢測顯示，濃度和純度均達(dá)到要求，可以滿足后續(xù)PCR檢測。PCR擴(kuò)增LRP-EGFP后瓊脂糖凝膠電泳鑒定顯示約1 800 bp的目的片段，證明外源基因已整合到犬小孢子菌基因組DNA中，見圖4。

四、LRP-EGFP融合蛋白的細(xì)胞定位分析

共聚焦顯微鏡下可觀察到極強(qiáng)的綠色熒光信號，LRP-EGFP的熒光信號呈顆粒狀或團(tuán)塊狀集中于收縮的犬小孢子菌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，見圖5。

討論

目前，已有多種多樣的技術(shù)手段運(yùn)用于探索蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，如亞細(xì)胞定位預(yù)測、特異性抗體免疫組化定位、融合報(bào)告基因定位等，其中融合報(bào)告基因定位法因具有簡單有效、準(zhǔn)確率高、可以活體樣本實(shí)時(shí)監(jiān)測的優(yōu)點(diǎn)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其原理是將目的蛋白基因與標(biāo)記蛋白基因拼接融合共表達(dá)，通過檢測標(biāo)記蛋白研究目標(biāo)蛋白，最常見的報(bào)告分子為GFP，是一種由239個(gè)氨基酸組成的單體蛋白［7］，其熒光反應(yīng)不需要任何底物及輔助因子，熒光穩(wěn)定，且其分子量相對較小，與其他蛋白融合后不影響自身的發(fā)光功能。本研究所用EGFP是將GFP的Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使熒光強(qiáng)度提高35倍，而且激發(fā)后16～24 h仍可穩(wěn)定地檢測到熒光［8］。我們成功構(gòu)建了pCAMBIA-LRP-EGFP表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將融合基因整合到犬小孢子菌基因組DNA，實(shí)現(xiàn)了Ptrpc和Ttrpc調(diào)控下LRP-EGFP融合基因在犬小孢子菌中的表達(dá)。將轉(zhuǎn)化后犬小孢子菌菌絲用0.5 mol/L山梨醇處理使其脫水，細(xì)胞膜與細(xì)胞壁分離后發(fā)現(xiàn)LRP-EGFP的熒光信號集中于收縮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，而在細(xì)胞壁未見明顯熒光信號，說明PQ-LRP蛋白定位于細(xì)胞膜。

PQ-LRP基因全長1 522 bp，含有一個(gè)1 080 bp的開放閱讀框（翻譯359個(gè)氨基酸）以及5′端非編碼區(qū)（49 bp）和3′端非編碼區(qū)（393 bp）。為使融合EGFP能準(zhǔn)確報(bào)告PQ-LRP基因在犬小孢子菌中的定位，避免遺漏可能存在的定位信號，且不影響EGFP蛋白折疊，我們利用SacⅠ與BamHⅠ酶切位點(diǎn)將PQ-LRP基因片段連接至EGFP的C端（上游），使PQ-LRP基因片段的插入對EGFP的表達(dá)無影響，測序結(jié)果證實(shí)PQ-LRP與EGFP閱讀框均無突變。

圖5 激光共聚焦顯微鏡分析LRP-EGFP重組蛋白在犬小孢子菌細(xì)胞中的定位

PQ-LRP蛋白是一種雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)的膜綁定蛋白，在真菌中普遍存在且與真菌的生長生存有密切聯(lián)系［9］。本研究組前期發(fā)現(xiàn)，犬小孢子菌PQ-LRP基因干擾株大分生孢子大小不一，形狀不規(guī)則，孢子壁皺褶破裂，分隔減少或缺如，細(xì)胞內(nèi)容物不均勻，出現(xiàn)空泡甚至缺失，推測犬小孢子菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁與PQ-LRP基因有密切聯(lián)系，當(dāng)外源性加入半胱氨酸時(shí)，野生株P(guān)Q-LRP基因表達(dá)水平隨半胱氨酸濃度的增加呈上升趨勢［5］，Xiao等［10］上調(diào)PQ-LRP基因表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)半胱氨酸代謝水平隨之提高，PQ-LRP可能通過影響半胱氨酸的合成代謝影響細(xì)胞壁主要成分幾丁質(zhì)的合成，使犬小孢子菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受到破壞。我們猜測PQ-LRP蛋白不僅參與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁成分的合成代謝，并且是犬小孢子菌細(xì)胞膜的重要組成部分。

本實(shí)驗(yàn)中，我們對犬小孢子菌PQ-LRP蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行初探，建立了一種適用于犬小孢子菌蛋白的GFP標(biāo)記方法，無論是對犬小孢子菌其他蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的研究，還是對進(jìn)一步探索PQLRP蛋白的結(jié)構(gòu)及與其他蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)制等，均提供了理論依據(jù)。