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        ELISA 在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室遇到的問題及解決方法

        2019-01-06 00:21:26張麗燕
        中國畜禽種業(yè) 2019年12期
        關(guān)鍵詞:標(biāo)板孵育抗原

        張麗燕

        (吉林省梅河口市動物疫病預(yù)防控制中心 135000)

        酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)最早出現(xiàn)于1971 年的Engvall E 等進(jìn)行的 IgG 定量測定中,隨后ELISA 以其操作簡便、樣品容量大、儀器化程度高、檢測成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)迅速發(fā)展成為一種新型免疫酶標(biāo)記技術(shù),在疫病診斷、食品安全、獸藥殘留等領(lǐng)域均顯示出了良好的應(yīng)用前景[1.2]。當(dāng)前幾乎所有的動物疫病都已經(jīng)研制或正在試圖研制ELISA 試劑盒,ELISA 在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中得到廣泛和普遍應(yīng)用。盡管ELISA 方法操作簡單,但ELISA 在實(shí)際操作過程中涉及的環(huán)節(jié)較多,在獸醫(yī)臨床實(shí)際應(yīng)用過程中如果對ELISA 方法的試驗(yàn)原理不夠理解或者對ELISA 方法的操作不太熟練,且受到試驗(yàn)條件、人為操作、環(huán)境因素等影響,極易出現(xiàn)假陰性、假陽性等問題,直接影響檢測結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性[3]。本文就基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用ELISA 方法進(jìn)行檢測中遇到的各種問題和解決方法進(jìn)行簡要闡述和分析,對全面理解和科學(xué)掌握ELISA 方法、保障試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確無誤、提高試驗(yàn)人員操作水平、提升基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測檢驗(yàn)?zāi)芰哂兄匾膮⒖純r(jià)值和指導(dǎo)意義。

        1 ELISA 方法的基本原理

        ELISA 方法的基本原理是基于酶分子與抗原或抗體分子的共價(jià)結(jié)合(即酶標(biāo)記抗原或抗體分子),該共價(jià)結(jié)合即沒有改變和降低抗原或抗體的免疫學(xué)特性,也沒有改變和降低酶的生物學(xué)活性[4]。在進(jìn)行檢測時(shí),首先利用抗原或抗體結(jié)合于固相載體表面,受檢樣品中抗體或抗原與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生特異性免疫學(xué)反應(yīng),再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體分子,最后通過加入與酶特異性反應(yīng)的底物液后顯色,根據(jù)顯色后顏色深淺可判定酶量,而酶量與受檢樣品中抗體或抗原的量具有一定相關(guān)性,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定性或定量分析。

        2 常見問題分析

        2.1 樣品采集或處理方法不合適

        血清樣品采集過程中出現(xiàn)溶血,此時(shí)樣品中可能含有過氧化物酶活性物質(zhì),此物質(zhì)可以與酶標(biāo)記的抗原抗體發(fā)生非特異性結(jié)合,改變底物顯色顏色的深淺,造成假陽性或假陰性結(jié)果。血清樣品處理過程中污染細(xì)菌,而部分菌體中含有內(nèi)源性過氧化物酶,造成假陽性或假陰性結(jié)果。血清樣品處理過程中如果經(jīng)過凍融,抗體蛋白分布不均勻,吸取的樣品未含有或少量含有抗體蛋白,造成假陽性或假陰性結(jié)果。

        2.2 試劑盒質(zhì)量下降

        由于試劑盒生產(chǎn)廠家較多,市場上試劑盒的質(zhì)量參差不齊,且同一生產(chǎn)廠家的不同批次試劑盒之間也存在較大差異,基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室如果選擇不合理,使用后造成檢測結(jié)果不確定,檢測結(jié)果的可重復(fù)性差。試劑盒在運(yùn)往基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室過程中未全程使用冷鏈運(yùn)輸或冷鏈運(yùn)輸達(dá)不到試劑盒要求,造成試劑盒質(zhì)量下降。基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在試劑盒使用過程中,試劑盒從冰箱拿出來后立即使用,由于試劑盒內(nèi)冷藏試劑未恢復(fù)至室溫,溫度達(dá)不到需求,造成試劑盒使用效果下降。在試劑盒使用后未及時(shí)放回冰箱,造成試劑盒內(nèi)冷藏試劑的質(zhì)量下降,影響試劑盒下次使用。

        2.3 加樣器使用不正確

        加樣器在吸取液體時(shí)速度過快,使槍頭內(nèi)具有氣泡,導(dǎo)致加樣量不足,影響檢測結(jié)果。加樣器在打出液體時(shí)速度過,使槍頭內(nèi)液體外濺,導(dǎo)致酶標(biāo)孔內(nèi)加樣量減少,影響檢測結(jié)果。向酶標(biāo)孔中加入液體時(shí)槍頭刮擦酶標(biāo)孔內(nèi)壁或槍頭插入太深而接觸酶標(biāo)孔底部,影響酶標(biāo)孔的吸附功能,增加檢測結(jié)果的假陽性率或假陰性率。加樣器在吸取不同液體時(shí)未及時(shí)更換槍頭,造成交叉污染,影響檢測結(jié)果。

        2.4 孵育方法不當(dāng)

        孵育時(shí)溫度達(dá)不到要求,溫度過高或過低直接影響抗原抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)的效果。孵育時(shí)酶標(biāo)板沒有利用封板膜密封,致使在孵育過程中酶標(biāo)孔內(nèi)液體逐步蒸發(fā),影響檢測結(jié)果,且干燥后的抗原抗體附著于酶標(biāo)孔內(nèi)壁,很難清洗掉,致使底物顯色后顏色過深。大批量樣品檢測時(shí)一般將多塊酶標(biāo)板疊放孵育,疊放過多造成中間的酶標(biāo)板孵育溫度不夠,而多塊酶標(biāo)板疊放可使ELISA 反應(yīng)出現(xiàn)邊緣效應(yīng),造成假陽性或假陰性的檢測結(jié)果。

        2.5 洗板方法不當(dāng)

        洗板時(shí)加入洗滌液過多,孔與孔之間的液體溢出,造成相互交叉污染。洗板時(shí)加入洗滌液過少,洗滌不徹底,造成假陽性或假陰性結(jié)果。洗板機(jī)的洗板針發(fā)生堵塞或吸液不暢,抽吸不完全造成洗板不徹底。大批量樣品檢測時(shí)酶標(biāo)板過多,出現(xiàn)排隊(duì)洗板且等待時(shí)間較長,造成洗板不徹底。

        2.6 顯色方法不當(dāng)

        當(dāng)有A、B 兩種液體為底物顯色夜時(shí),顯色液配制時(shí)間過早造成顯色效果下降。加入顯色劑時(shí)有液體濺出孔外造成跳孔,發(fā)生污染。大批量樣品檢測時(shí)由于酶標(biāo)板過多,部分酶標(biāo)板可能出現(xiàn)顯色時(shí)間過長,影響檢測結(jié)果。

        3 解決方法探討

        3.1 合理采集和處理樣品

        血清樣品采集過程中應(yīng)避免出現(xiàn)溶血,對于已經(jīng)出現(xiàn)溶血的樣品應(yīng)舍棄,重新采集。血清樣品處理過程中應(yīng)避免污染細(xì)菌和反復(fù)凍融,已經(jīng)污染細(xì)菌的血清樣品可通過離心方法去除細(xì)菌,對于菌體已經(jīng)破裂的樣品應(yīng)舍棄,不予檢測。凍融后的血清樣品應(yīng)緩慢混合均勻,避免強(qiáng)烈振蕩。

        3.2 合理選擇和使用試劑盒

        在試劑盒采購時(shí),應(yīng)選擇具有批準(zhǔn)文號的正規(guī)生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的試劑盒,避免試劑盒濫用。在試劑盒運(yùn)輸和保存過程中應(yīng)保證全程冷鏈,避免試劑盒質(zhì)量下降。在試劑盒使用前應(yīng)將試劑恢復(fù)至室溫后使用,避免試劑溫度對檢測結(jié)果造成影響。在試劑盒使用后,應(yīng)將試劑盒及時(shí)放回冰箱,避免試劑盒質(zhì)量下降。

        3.3 正確使用加樣器

        加樣器在吸取和打出液體時(shí)應(yīng)避免速度過快,做到穩(wěn)吸取和穩(wěn)打出。加樣器在向酶標(biāo)孔中加入液體時(shí)避免槍頭觸及酶標(biāo)孔內(nèi)壁或底部,加樣器在吸取不同液體時(shí)應(yīng)及時(shí)更換槍頭。

        3.4 掌握正確孵育方法

        開始孵育前應(yīng)提前開啟溫箱,并利用溫度計(jì)準(zhǔn)確測定溫箱內(nèi)溫度,避免溫度過高或過低。孵育前應(yīng)將酶標(biāo)板利用封板膜進(jìn)行密封。大批量樣品檢測時(shí)盡量避免將多塊酶標(biāo)板疊放孵育,如實(shí)驗(yàn)條件實(shí)在有限,必須疊放時(shí)應(yīng)超過3 塊。

        3.5 掌握正確洗板方法

        洗板前應(yīng)調(diào)節(jié)洗滌液至合適體積,避免洗滌液過多或過少。洗板前應(yīng)徹底檢查洗板機(jī),保證洗板機(jī)的每個針孔均通暢無阻。大批量樣品檢測時(shí)應(yīng)控制檢測樣品數(shù)量,每次試驗(yàn)最好酶標(biāo)板控制在20 塊板以內(nèi),不要太多。

        3.6 掌握正確顯色方法

        顯色夜應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用,嚴(yán)禁使用長時(shí)間配制后的顯色夜,每次使用后剩余的顯色液應(yīng)及時(shí)舍棄。加入顯色劑時(shí)應(yīng)緩慢加入,避免液體濺出孔外造成污染。顯色時(shí)間對顯色效果至關(guān)重要,大批量樣品檢測時(shí)應(yīng)盡量爭取同一時(shí)間顯色,顯色時(shí)間越統(tǒng)一,檢測結(jié)果的誤差越小。

        4 結(jié)語

        總之,基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用ELISA 方法進(jìn)行檢測時(shí),應(yīng)加強(qiáng)對ELISA 方法基本原理的理解和掌握,合理采集和處理樣品,合理選擇和使用試劑盒,掌握正確的加樣方法、孵育方法、洗板方法和顯色方法,降低各種影響因素對檢測結(jié)果的影響,注重試驗(yàn)操作細(xì)節(jié),認(rèn)真學(xué)習(xí)和不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn),提升檢測水平,保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確無誤,不斷為動物疫病的防控保駕護(hù)航。

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