張麗燕

（吉林省梅河口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 135000）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）最早出現(xiàn)于1971 年的Engvall E 等進(jìn)行的 IgG 定量測(cè)定中，隨后ELISA 以其操作簡(jiǎn)便、樣品容量大、儀器化程度高、檢測(cè)成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)迅速發(fā)展成為一種新型免疫酶標(biāo)記技術(shù)，在疫病診斷、食品安全、獸藥殘留等領(lǐng)域均顯示出了良好的應(yīng)用前景[1.2]。當(dāng)前幾乎所有的動(dòng)物疫病都已經(jīng)研制或正在試圖研制ELISA 試劑盒，ELISA 在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中得到廣泛和普遍應(yīng)用。盡管ELISA 方法操作簡(jiǎn)單，但ELISA 在實(shí)際操作過(guò)程中涉及的環(huán)節(jié)較多，在獸醫(yī)臨床實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中如果對(duì)ELISA 方法的試驗(yàn)原理不夠理解或者對(duì)ELISA 方法的操作不太熟練，且受到試驗(yàn)條件、人為操作、環(huán)境因素等影響，極易出現(xiàn)假陰性、假陽(yáng)性等問(wèn)題，直接影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性[3]。本文就基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)中遇到的各種問(wèn)題和解決方法進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述和分析，對(duì)全面理解和科學(xué)掌握ELISA 方法、保障試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤、提高試驗(yàn)人員操作水平、提升基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)檢驗(yàn)?zāi)芰哂兄匾膮⒖純r(jià)值和指導(dǎo)意義。

1 ELISA 方法的基本原理

ELISA 方法的基本原理是基于酶分子與抗原或抗體分子的共價(jià)結(jié)合（即酶標(biāo)記抗原或抗體分子），該共價(jià)結(jié)合即沒(méi)有改變和降低抗原或抗體的免疫學(xué)特性，也沒(méi)有改變和降低酶的生物學(xué)活性[4]。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，首先利用抗原或抗體結(jié)合于固相載體表面，受檢樣品中抗體或抗原與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體分子，最后通過(guò)加入與酶特異性反應(yīng)的底物液后顯色，根據(jù)顯色后顏色深淺可判定酶量，而酶量與受檢樣品中抗體或抗原的量具有一定相關(guān)性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定性或定量分析。

2 常見(jiàn)問(wèn)題分析

2.1 樣品采集或處理方法不合適

血清樣品采集過(guò)程中出現(xiàn)溶血，此時(shí)樣品中可能含有過(guò)氧化物酶活性物質(zhì)，此物質(zhì)可以與酶標(biāo)記的抗原抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，改變底物顯色顏色的深淺，造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。血清樣品處理過(guò)程中污染細(xì)菌，而部分菌體中含有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。血清樣品處理過(guò)程中如果經(jīng)過(guò)凍融，抗體蛋白分布不均勻，吸取的樣品未含有或少量含有抗體蛋白，造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。

2.2 試劑盒質(zhì)量下降

由于試劑盒生產(chǎn)廠家較多，市場(chǎng)上試劑盒的質(zhì)量參差不齊，且同一生產(chǎn)廠家的不同批次試劑盒之間也存在較大差異，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室如果選擇不合理，使用后造成檢測(cè)結(jié)果不確定，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差。試劑盒在運(yùn)往基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室過(guò)程中未全程使用冷鏈運(yùn)輸或冷鏈運(yùn)輸達(dá)不到試劑盒要求，造成試劑盒質(zhì)量下降?；鶎荧F醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在試劑盒使用過(guò)程中，試劑盒從冰箱拿出來(lái)后立即使用，由于試劑盒內(nèi)冷藏試劑未恢復(fù)至室溫，溫度達(dá)不到需求，造成試劑盒使用效果下降。在試劑盒使用后未及時(shí)放回冰箱，造成試劑盒內(nèi)冷藏試劑的質(zhì)量下降，影響試劑盒下次使用。

2.3 加樣器使用不正確

加樣器在吸取液體時(shí)速度過(guò)快，使槍頭內(nèi)具有氣泡，導(dǎo)致加樣量不足，影響檢測(cè)結(jié)果。加樣器在打出液體時(shí)速度過(guò)，使槍頭內(nèi)液體外濺，導(dǎo)致酶標(biāo)孔內(nèi)加樣量減少，影響檢測(cè)結(jié)果。向酶標(biāo)孔中加入液體時(shí)槍頭刮擦酶標(biāo)孔內(nèi)壁或槍頭插入太深而接觸酶標(biāo)孔底部，影響酶標(biāo)孔的吸附功能，增加檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性率或假陰性率。加樣器在吸取不同液體時(shí)未及時(shí)更換槍頭，造成交叉污染，影響檢測(cè)結(jié)果。

2.4 孵育方法不當(dāng)

孵育時(shí)溫度達(dá)不到要求，溫度過(guò)高或過(guò)低直接影響抗原抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)的效果。孵育時(shí)酶標(biāo)板沒(méi)有利用封板膜密封，致使在孵育過(guò)程中酶標(biāo)孔內(nèi)液體逐步蒸發(fā)，影響檢測(cè)結(jié)果，且干燥后的抗原抗體附著于酶標(biāo)孔內(nèi)壁，很難清洗掉，致使底物顯色后顏色過(guò)深。大批量樣品檢測(cè)時(shí)一般將多塊酶標(biāo)板疊放孵育，疊放過(guò)多造成中間的酶標(biāo)板孵育溫度不夠，而多塊酶標(biāo)板疊放可使ELISA 反應(yīng)出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，造成假陽(yáng)性或假陰性的檢測(cè)結(jié)果。

2.5 洗板方法不當(dāng)

洗板時(shí)加入洗滌液過(guò)多，孔與孔之間的液體溢出，造成相互交叉污染。洗板時(shí)加入洗滌液過(guò)少，洗滌不徹底，造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。洗板機(jī)的洗板針發(fā)生堵塞或吸液不暢，抽吸不完全造成洗板不徹底。大批量樣品檢測(cè)時(shí)酶標(biāo)板過(guò)多，出現(xiàn)排隊(duì)洗板且等待時(shí)間較長(zhǎng)，造成洗板不徹底。

2.6 顯色方法不當(dāng)

當(dāng)有A、B 兩種液體為底物顯色夜時(shí)，顯色液配制時(shí)間過(guò)早造成顯色效果下降。加入顯色劑時(shí)有液體濺出孔外造成跳孔，發(fā)生污染。大批量樣品檢測(cè)時(shí)由于酶標(biāo)板過(guò)多，部分酶標(biāo)板可能出現(xiàn)顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響檢測(cè)結(jié)果。

3 解決方法探討

3.1 合理采集和處理樣品

血清樣品采集過(guò)程中應(yīng)避免出現(xiàn)溶血，對(duì)于已經(jīng)出現(xiàn)溶血的樣品應(yīng)舍棄，重新采集。血清樣品處理過(guò)程中應(yīng)避免污染細(xì)菌和反復(fù)凍融，已經(jīng)污染細(xì)菌的血清樣品可通過(guò)離心方法去除細(xì)菌，對(duì)于菌體已經(jīng)破裂的樣品應(yīng)舍棄，不予檢測(cè)。凍融后的血清樣品應(yīng)緩慢混合均勻，避免強(qiáng)烈振蕩。

3.2 合理選擇和使用試劑盒

在試劑盒采購(gòu)時(shí)，應(yīng)選擇具有批準(zhǔn)文號(hào)的正規(guī)生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的試劑盒，避免試劑盒濫用。在試劑盒運(yùn)輸和保存過(guò)程中應(yīng)保證全程冷鏈，避免試劑盒質(zhì)量下降。在試劑盒使用前應(yīng)將試劑恢復(fù)至室溫后使用，避免試劑溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。在試劑盒使用后，應(yīng)將試劑盒及時(shí)放回冰箱，避免試劑盒質(zhì)量下降。

3.3 正確使用加樣器

加樣器在吸取和打出液體時(shí)應(yīng)避免速度過(guò)快，做到穩(wěn)吸取和穩(wěn)打出。加樣器在向酶標(biāo)孔中加入液體時(shí)避免槍頭觸及酶標(biāo)孔內(nèi)壁或底部，加樣器在吸取不同液體時(shí)應(yīng)及時(shí)更換槍頭。

3.4 掌握正確孵育方法

開(kāi)始孵育前應(yīng)提前開(kāi)啟溫箱，并利用溫度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定溫箱內(nèi)溫度，避免溫度過(guò)高或過(guò)低。孵育前應(yīng)將酶標(biāo)板利用封板膜進(jìn)行密封。大批量樣品檢測(cè)時(shí)盡量避免將多塊酶標(biāo)板疊放孵育，如實(shí)驗(yàn)條件實(shí)在有限，必須疊放時(shí)應(yīng)超過(guò)3 塊。

3.5 掌握正確洗板方法

洗板前應(yīng)調(diào)節(jié)洗滌液至合適體積，避免洗滌液過(guò)多或過(guò)少。洗板前應(yīng)徹底檢查洗板機(jī)，保證洗板機(jī)的每個(gè)針孔均通暢無(wú)阻。大批量樣品檢測(cè)時(shí)應(yīng)控制檢測(cè)樣品數(shù)量，每次試驗(yàn)最好酶標(biāo)板控制在20 塊板以?xún)?nèi)，不要太多。

3.6 掌握正確顯色方法

顯色夜應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，嚴(yán)禁使用長(zhǎng)時(shí)間配制后的顯色夜，每次使用后剩余的顯色液應(yīng)及時(shí)舍棄。加入顯色劑時(shí)應(yīng)緩慢加入，避免液體濺出孔外造成污染。顯色時(shí)間對(duì)顯色效果至關(guān)重要，大批量樣品檢測(cè)時(shí)應(yīng)盡量爭(zhēng)取同一時(shí)間顯色，顯色時(shí)間越統(tǒng)一，檢測(cè)結(jié)果的誤差越小。

4 結(jié)語(yǔ)

總之，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在應(yīng)用ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)ELISA 方法基本原理的理解和掌握，合理采集和處理樣品，合理選擇和使用試劑盒，掌握正確的加樣方法、孵育方法、洗板方法和顯色方法，降低各種影響因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，注重試驗(yàn)操作細(xì)節(jié)，認(rèn)真學(xué)習(xí)和不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，提升檢測(cè)水平，保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤，不斷為動(dòng)物疫病的防控保駕護(hù)航。