呂昱帆, 王繼芬*, 常 靖, 李 超, 彭山珊

(1. 中國人民公安大學刑事科學技術(shù)學院, 北京 100038; 2. 公安部物證鑒定中心, 北京 100038)

海洛因,即二乙酰嗎啡,是目前濫用最廣泛的半合成鴉片類毒品。盡管近年來新型毒品層出不窮,但根據(jù)聯(lián)合國世界毒品報告,海洛因全球濫用人數(shù)僅次于大麻和可卡因,且近4年來人數(shù)有上升趨勢。由于海洛因攝入方式多為注射,海洛因濫用人群中發(fā)生HIV病毒感染和注射過量死亡事件的風險更高[1,2]。海洛因進入人體后的半衰期僅為3 min,會迅速代謝為具有活性的6-單乙酰嗎啡(6-MAM)[3]和無活性的3-單乙酰嗎啡(少量),此后單乙酰嗎啡進一步降解為嗎啡,上述代謝物進入肝臟后與蛋白質(zhì)結(jié)合,形成相應的葡萄糖醛酸結(jié)合物[4]。目前對海洛因攝入的確認,多采用同時檢驗血液、肝臟中6-單乙酰嗎啡和嗎啡的方式。腐敗檢材中毒品的檢驗一直是實際工作以及世界法庭毒物學中的難題,腐敗檢材基質(zhì)效應大,提取回收率低,常規(guī)的檢驗方法無法滿足實踐中檢驗腐敗檢材中毒品的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Shimadzu Nexera 30A-LC超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司); API 5500 QTRAP?三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司); Analyst工作站(美國ABSCIEX公司);臺式高速冷凍離心機(美國Thormo Fisher科技公司); Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)。

乙腈、甲醇、甲酸(HPLC級,美國Fisher公司); 10%(v/v)氨水(HPLC級,美國Mreda公司);無水硫酸鎂、無水氯化鈉、無水乙酸鈉(分析純,國藥集團); C18SPE吸附劑(美國Agilent公司);N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑(天津Agela科技公司);石墨化炭黑(GCB)吸附劑(美國Sepax科技公司)。

標準對照品:嗎啡鹽酸鹽、6-單乙酰嗎啡鹽酸鹽,由公安部禁毒情報中心提供。

空白血由首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院提供。

1.2 標準溶液配制

標準儲備液:分別準確稱量5.00 mg嗎啡鹽酸鹽和6-單乙酰嗎啡鹽酸鹽,用甲醇溶解定容至5.00 mL,配制成1.00 g/L的標準儲備液,于-20 ℃條件下保存?；旌蠘藴嗜芤?分別吸取適量標準儲備液,用甲醇稀釋,配制成質(zhì)量濃度為20 mg/L的混合標準溶液,于-20 ℃條件下保存。系列混合標準工作液由混合標準溶液用甲醇逐級稀釋配制而成,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 腐敗血制備

將新鮮空白血置于25 ℃恒溫箱中,取下密封蓋使血液與空氣直接接觸,模擬血液在一般室溫條件下腐敗的情況,分別于10天、20天、30天后取出,于-20 ℃冷凍備用。隨腐敗時間的延長,可觀察到血液黏度增大,顏色由鮮紅變?yōu)榘导t以至褐色,有動物組織腐敗的臭味。

1.4 樣品前處理

取0.5 mL空白血于15 mL離心管中,添加10 μL混合標準溶液,渦旋10 s后靜置1 min,使標準溶液與空白血充分混合。

向上述加標樣品中加入2 mL乙腈-水混合溶液(4∶1, v/v),并加入30 mg氯化鈉和60 mg無水硫酸鎂,振蕩10 min,充分混勻。在8 000 r/min下離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一15 mL離心管中,加入25 mg PSA和25 mg無水硫酸鎂,渦旋10 s,充分混勻后在8 000 r/min下離心5 min。取上清液過0.22 μm有機膜過濾,濾液供UPLC-MS/MS分析。

1.5 分析條件

1.5.1質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源正離子(ESI+)模式,多反應監(jiān)測(MRM)掃描模式;離子源電壓(IS): 5 500 V;離子源溫度(TEM): 650 ℃;氣簾氣(CUR)壓強:0.30 MPa;霧化氣(GS1)壓強:0.50 MPa;輔助氣(GS2)壓強:0.55 MPa;碰撞氣(CAD)強度:Medium。

嗎啡和6-單乙酰嗎啡的質(zhì)譜優(yōu)化采集參數(shù)見表1。

表 1 嗎啡和6-單乙酰嗎啡的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of morphine and 6-monoacetylmorphine

*Quantitative ion.

1.5.2超高效液相色譜條件

選用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),柱溫40 ℃; 0.01%(v/v)氨水(A相)和乙腈(B相)作為流動相,流速0.4 mL/min。采用4 min梯度洗脫模式:0.0～0.1 min, 10%B; 0.1～1.2 min, 10%B～50%B; 1.2～2.8 min, 50%B; 2.8～2.9 min, 50%B～10%B; 2.9～4.0 min, 10%B。進樣量為1 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器檢測條件優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用ESI+模式,使用注射針泵分別向質(zhì)譜中注入嗎啡和6-單乙酰嗎啡,通過一級全掃描獲取目標物的母離子[M+H]+,再通過二級質(zhì)譜裂解分析,分別選出強度最高的3個子離子,與母離子組成3個離子對。進一步對選出的離子對進行碰撞能量、去簇電壓等參數(shù)的優(yōu)化,最終選定定性和定量分析離子。

2.1.2色譜條件優(yōu)化

選用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)進行分離。

實驗比較了水(A相)和乙腈(B相)、0.1%(v/v)甲酸-水(A相)和乙腈(B相)、0.01%(v/v)氨水(A相)和乙腈(B相)3種流動相。結(jié)果表明,使用水(A相)和乙腈(B相)作為流動相時,嗎啡和6-單乙酰嗎啡響應低,且保留時間集中,無法分離;使用0.1%(v/v)甲酸-水(A相)和乙腈(B相)作為流動相時,兩種化合物分離效果較好,但嗎啡峰形過寬,無法達到分析檢測的要求;0.01%(v/v)氨水(A相)和乙腈(B相)為流動相,目標物分離效果和響應強度均較好,色譜峰形對稱、峰寬窄、干擾峰低。最終選擇0.01%(v/v)氨水(A相)和乙腈(B相)作為流動相。

實驗比較了4種梯度洗脫程序分離目標物的效果。(1) 0.0～0.1 min, 10%B; 0.1～1.2 min, 10%B～50%B; 1.2～2.8 min, 50%B; 2.8～2.9 min, 50%B～10%B; 2.9～4.0 min, 10%B。(2) 0.0～0.1 min, 10%B; 0.1～2.8 min, 10%B～80%B; 2.8～2.9 min, 80%B～10%B; 2.9～4.0 min, 10%B。(3) 0.0～0.1 min, 10%B; 0.1～0.9 min, 10%B～35%B; 0.9～3.0 min, 35%B～80%B; 3.0～3.5 min, 80%B; 3.5～3.9 min, 80%B～10%B; 3.9～4.0 min, 10%B。(4) 0.0～0.1 min, 5%B; 0.1～0.9 min, 5%B～25%B; 0.9～3.0 min, 25%B～50%B; 3.0～3.5 min, 50%B; 3.5～3.9 min, 50%B～5%B; 3.9～4.0 min, 5%B。實驗結(jié)果顯示,第1種梯度洗脫程序?qū)δ繕宋锓蛛x效果最佳。嗎啡和6-單乙酰嗎啡的色譜圖見圖1。

圖 1 嗎啡和6-單乙酰嗎啡的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatogram of morphine and 6-monoacetylmorphine

2.2 QuEChERS前處理條件優(yōu)化

腐敗血中不僅含有大腸桿菌、大腸腐敗桿菌、腸球菌等為主的活體細菌,還含有由于腐敗產(chǎn)生的小分子胺類、醇類,以及大分子蛋白質(zhì)、脂肪、多糖降解產(chǎn)物等[15]。由于基質(zhì)復雜,腐敗血樣品檢驗分析結(jié)果往往回收率低、檢出限高。本實驗使用QuEChERS方法對腐敗血樣品前處理,萃取溶劑的優(yōu)化已在此前發(fā)表的文章中闡述[24],此處不再贅述。

圖 3 使用不同質(zhì)量MgSO4時嗎啡和6-單乙酰嗎啡的回收率Fig. 3 Recoveries of morphine and 6-monoacetylmorphine with different amounts of anhydrous magnesium sulfate

2.2.1鹽析劑優(yōu)化

鹽析劑的加入可促使萃取溶劑中的有機相與基質(zhì)分層,促使目標物向有機相中轉(zhuǎn)移。NaCl和MgSO4是QuEChERS方法中最常用的鹽析劑,其中NaCl的鹽析作用可提高極性物質(zhì)的回收率,MgSO4則能夠吸收有機相中多余的水分,提高目標物的回收率。除此之外,還有一些具有緩沖作用的鹽析劑,如無水乙酸鈉(NaAc)、無水檸檬酸鈉(NaCit)等。實驗比較了QuEChERS前處理方法中常用的鹽析劑NaCl和具有緩沖作用的鹽析劑NaAc對嗎啡和6-單乙酰嗎啡的提取效果,以回收率為評價指標。圖2為加入不同質(zhì)量NaCl和NaAc前處理后,嗎啡和6-單乙酰嗎啡的回收率變化情況。

NaCl作為鹽析劑時,隨加入的NaCl質(zhì)量變化,嗎啡和6-單乙酰嗎啡的回收率變化趨勢基本一致,且NaCl質(zhì)量為30 mg時腐敗血中嗎啡和6-單乙酰嗎啡的回收率均達到最高值,分別為80.9%和106.8%。無水NaAc作為鹽析劑時,隨NaAc質(zhì)量變化,腐敗血中嗎啡和6-單乙酰嗎啡的回收率變化趨勢不一致,當加入無水NaAc 40 mg時,兩者達到較高的回收率,分別為71.1%和84.1%。由此比較可以得出,NaCl作為鹽析劑時的提取效果更優(yōu)。

圖 2 使用不同質(zhì)量(a)NaCl和(b)NaAc時嗎啡和 6-單乙酰嗎啡的回收率Fig. 2 Recoveries of morphine and 6-monoacetylmorphine with different amounts of (a) anhydrous sodium chloride and (b) anhydrous sodium acetate (NaAc)

鹽析劑除NaCl外,還應加入無水MgSO4以吸收有機相中的水分,并促使有機相與基質(zhì)的分離。實驗考查了無水MgSO4與NaCl質(zhì)量比分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1以及不加無水MgSO4時,腐敗血中嗎啡和6-單乙酰嗎啡的回收率(見圖3)。當加入不同質(zhì)量無水MgSO4時,6-單乙酰嗎啡的回收率在90%～110%之間波動,嗎啡的回收率在加入無水MgSO460 mg時達到最高,為85.5%。

綜合以上結(jié)果,實驗最終以30 mg NaCl和60 mg無水MgSO4作為鹽析劑。

2.2.2凈化劑選擇

腐敗血中的脂肪酸、油脂等內(nèi)源性物質(zhì)較新鮮血更多,前處理應盡可能除去樣品中的雜質(zhì)以降低基質(zhì)效應,同時最大限度保留目標物,保證較高的回收率。

圖 4 使用不同凈化劑時嗎啡和6-單乙酰嗎啡的回收率(n=5)Fig. 4 Recoveries of morphine and 6-monoacetylmorphine with different sorbents (n=5) PSA: primary secondary amine sorbent; GCB: graphitized carbon black sorbent.

CompoundLinear range/(μg/L)Linear equationr2LOD/(μg/L)LOQ/(μg/L)Morphine5-200y=102.2x+179.30.9998156-Monoacetylmorphine5-200y=193.35x+188.280.995715y: peak area; x: mass concentration, μg/L.表 3 嗎啡和6-單乙酰嗎啡在腐敗血中的加標回收率(R)、基質(zhì)效應和相對標準偏差(n=5)Table 3 Recoveries (R), matrix effects (ME) and RSDs of morphine and 6-monoacetylmorphine spiked in putrefied blood (n=5)Putrefied duration/dAdded/(μg/L)MorphineR±SD/%ME±SD/%Intra-day RSD/%Inter-day RSD/%6-MonoacetylmorphineR±SD/%ME±SD/%Intra-day RSD/%Inter-day RSD/%10 5103.44±0.1383.55±0.1610.310.7104.46±0.1883.04±0.059.112.3100102.43±0.0383.98±0.041.45.893.85±0.1089.69±0.039.72.420085.47±0.0984.36±0.0911.43.583.67±0.1494.04±0.0511.23.820589.43±0.1696.76±0.056.010.298.64±0.1884.94±0.025.28.110084.31±0.0584.32±0.0111.85.992.53±0.1991.09±0.0510.62.420081.84±0.15106.08±0.105.38.182.84±0.04107.61±0.046.68.830589.30±0.0685.60±0.0311.04.083.96±0.0598.66±0.025.17.610092.17±0.0598.34±0.033.63.281.22±0.0390.82±0.032.14.420090.04±0.0384.47±0.034.54.081.03±0.03100.14±0.025.18.8

實驗比較了QuEChERS方法中常用的3種凈化劑:C18吸附劑、PSA和GCB(見圖4)。實驗首先比較了凈化階段分別加入25 mg C18吸附劑、PSA和GCB時嗎啡和6-單乙酰嗎啡的回收率。實驗結(jié)果顯示,PSA作為凈化劑時目標物回收率仍在較高水平,進而考察分別加入10、25和35 mg PSA時目標物的回收率。結(jié)果表明,PSA質(zhì)量為25 mg時,嗎啡和6-單乙酰嗎啡的回收率更高,且此時基質(zhì)效應為80%～110%。在此基礎上再加入25 mg MgSO4,目標物回收率仍保持在較高水平,基質(zhì)效應有所減小,為84%～107%。因此,實驗最終確定以25 mg PSA和25 mg MgSO4作為凈化劑。

2.3 方法學考察

2.3.1線性范圍與檢出限、定量限

在優(yōu)化的實驗條件下進行方法評價。取空白全血8份各0.5 mL,添加10 μL適當質(zhì)量濃度的嗎啡和6-單乙酰嗎啡混合標準溶液,分別配制成0.5、1、5、10、20、50、100、200 μg/L的加標血液樣品,按1.4節(jié)前處理方法操作,再進行UPLC-MS/MS分析。以目標物的質(zhì)量濃度(x, μg/L)和峰面積(y)進行線性回歸,以3倍信噪比(S/N)對應的添加水平作為檢出限(LOD),以10倍S/N對應的添加水平作為定量限(LOQ),結(jié)果見表2。

2.3.2回收率、基質(zhì)效應與精密度

分別取腐敗程度不同的血液樣品,添加低、中、高3個水平(5、100、200 μg/L)的混合標準溶液,按照1.4節(jié)方法前處理,以選定的儀器條件進行檢測。通過對比峰面積平均值計算回收率(R)和基質(zhì)效應(ME):R=Z/Y×100%, ME=Y/X×100%;其中X為儀器分析標準品溶液所得峰面積,Y為空白血樣經(jīng)前處理提取凈化后加入混合標準品溶液分析所得峰面積,Z為添加混合標準品溶液后的血樣經(jīng)前處理提取凈化后儀器分析所得峰面積[25]。結(jié)果見表3。

2.4 動物實驗樣品檢測

取3只雄性成年SD大鼠,體重分別為146、150、144 g,依次編號1、2、3。1號鼠為空白,2號和3號分別尾靜脈注射0.46 mg海洛因(生理鹽水稀釋至1 mL)。給藥后2小時采用斷頭法處死并取血、取肝臟。樣品采集后置于-20 ℃冰箱中備檢,同時取部分2號、3號大鼠血、肝臟于25 ℃恒溫箱中腐敗20天。

按本研究優(yōu)化后的方法對1、2、3號大鼠新鮮血和肝臟樣品,2、3號大鼠腐敗20天血和肝臟樣品進行檢驗。1號空白大鼠血液及肝臟樣品中未檢出嗎啡和6-單乙酰嗎啡;2、3號大鼠新鮮血中嗎啡濃度分別為20.1、26.5 μg/L;腐敗血中嗎啡濃度分別為2.1、2.8 mg/L。2、3號大鼠新鮮肝臟樣品中嗎啡濃度分別為642.4、537.8 μg/kg;腐敗肝臟樣品中嗎啡濃度分別為825.4、844.3 μg/kg。上述血液和肝臟樣品均未檢出6-單乙酰嗎啡。

針對上述動物實驗樣品檢驗未檢出6-單乙酰嗎啡的現(xiàn)象,依據(jù)Rook等[26]的研究,6-單乙酰嗎啡在生物體內(nèi)半衰期為21.8 min,且依據(jù)陳躍等[27]的研究,攝入較低給藥量海洛因時,血液中海洛因代謝物6-單乙酰嗎啡檢測時限較短為1.5 h,此時樣品中可能存在低于檢出限濃度的6-單乙酰嗎啡。而腐敗前后嗎啡的濃度變化與于曉巍等[28]研究結(jié)果一致,在較高溫度時,6-單乙酰嗎啡以較快速度降解成嗎啡。

3 結(jié)論

本文改良了QuEChERS前處理方法,建立了同時檢驗腐敗血中的嗎啡和6-單乙酰嗎啡的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,有效降低了腐敗血樣品的基質(zhì)效應,同時具有較高回收率,方法靈敏度高、準確可靠,能夠快速準確地實現(xiàn)腐敗血中嗎啡和6-單乙酰嗎啡的定量檢驗。該方法可為復雜的腐敗生物樣品中海洛因代謝物的檢驗提供解決方案,同時為疑難生物樣品中其他毒品、藥物成分的檢驗提供方法基礎。