馮 峰, 李偉明, 孫 燕,3, 張 峰*

(1. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所, 北京 100176; 2. 番禺出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 511400; 3. 北京中醫(yī)藥大學(xué), 北京 100029)

甜菊糖苷是從菊科草本植物甜葉菊葉中提取的高甜度、低熱量的天然甜味劑,被譽(yù)為繼甘蔗糖、甜菜糖之后的“第三代健康糖源”[1]。由于其甜度是蔗糖的200～350倍,且屬于天然來源,因此,目前越來越多的食品中加入甜菊糖苷以吸引消費(fèi)者。研究表明,如果長期過量食用甜味劑,會對身體帶來較大傷害。我國《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2014)中明確規(guī)定蒸餾酒中不允許添加甜味劑,配制酒和飲料中的甜味劑的使用也不得超過限量[2]。然而,一些企業(yè)為了逃避監(jiān)管,在白酒和飲料中添加甜味劑的情況仍時有發(fā)生。

目前,對于食品中甜味劑的檢測,文獻(xiàn)報(bào)道的大多還是針對人工合成甜味劑的檢測,主要有毛細(xì)管電泳法[3,4]、液相色譜法[5-8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-15]等。天然甜味劑則因異構(gòu)體多,成分復(fù)雜,目前研究的還較少。范廣宇等[13]報(bào)道了一種使用親水作用色譜-液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜同時檢測人工和天然甜味劑的方法,但這種方法只能針對特定的甜味劑使用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測,無法對不斷出現(xiàn)的新合成甜味劑進(jìn)行快速精準(zhǔn)篩查和回顧性分析。

本研究建立了一種基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜進(jìn)行白酒和飲料中甜菊糖苷類甜味劑非靶標(biāo)的篩查方法,該方法不僅可以實(shí)現(xiàn)8種甜菊糖苷類甜味劑的精準(zhǔn)定量,而且基于篩選出的甜菊糖苷類化合物的標(biāo)識性碎片離子,還可以對樣品中未知甜菊糖苷進(jìn)行非靶標(biāo)篩查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)及Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司);分析天平XP 105(瑞士Mettler公司); Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

甜菊苷(stevioside)、瑞鮑迪苷B(rebaudioside B)、瑞鮑迪苷D(rebaudioside D)、瑞鮑迪苷F(rebaudioside F)和杜克苷A(dulcoside A)購自美國ChromaDex公司;瑞鮑迪苷A(rebaudioside A)、瑞鮑迪苷C(rebaudioside C)和甜菊雙糖苷(steviolbioside)購自北京百靈威公司;以上化合物純度均大于97%。乙腈(色譜純)和甲酸銨(優(yōu)級純)購自美國Fisher公司。白酒和飲料樣品購自超市和電商平臺。

1.2 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品,分別用水溶解,配制成1 000 mg/L的儲備液,于4 ℃儲存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別取8種甜菊糖苷的儲備液,用乙腈-水(65∶35, v/v)配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃儲存,使用時根據(jù)需要用水或空白白酒樣品稀釋到所需濃度。

1.3 樣品制備

對于白酒樣品,準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品,用流動相進(jìn)行5～10倍稀釋后,過0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)測定。對于飲料樣品,準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品,直接過0.22 μm水相濾膜后上機(jī)測定。

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters XBridge Amide色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm);柱溫:35 ℃。流動相:乙腈-10 mmol/L甲酸銨(65∶35, v/v);流速:0.4 mL/min。進(jìn)樣體積:5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

加熱電噴霧離子源(HESI),負(fù)離子模式;噴霧電壓:-3.0 kV;毛細(xì)管溫度:320 ℃;加熱器溫度:50 ℃;鞘氣:氮?dú)?流速為40 arb;輔助氣:氮?dú)?流速為5 arb;掃描模式:一級母離子全掃描和數(shù)據(jù)依賴的二級子離子掃描(full MS/dd-MS2)模式。一級母離子全掃描分辨率:7×104半高峰寬(FWHM);最大注 入時間:200ms;采集范圍:m/z150～1 200。數(shù)據(jù)依賴二級子離子掃描分辨率:1.75×104FWHM;觸發(fā)閾值:1×105;最大注入時間:50 ms。8種天然甜味劑的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表 1 8種甜菊糖苷的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of the eight steviol glycosides

圖 1 8種甜菊糖苷的超高效液相色譜-四極桿/靜電場 軌道阱質(zhì)譜提取離子色譜圖Fig. 1 Extract ion chromatograms of the eight steviol glycosides using ultra high performance liquid chromatography-quadrurpole/Orbitrap mass spectrometry

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本研究采用Q Exactive高分辨質(zhì)譜的full MS/dd-MS2模式進(jìn)行甜菊糖苷類化合物的分析,通過使用目標(biāo)化合物的精確分子離子質(zhì)量數(shù),結(jié)合二級碎片離子譜的分析,可以實(shí)現(xiàn)在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,對樣品中有無甜菊糖苷類化合物進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定。設(shè)定母離子的掃描范圍為m/z150～1 200,不僅涵蓋目前能夠獲得的8種甜菊糖苷類標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量范圍,而且覆蓋到了絕大多數(shù)甜菊糖苷類化合物的相對分子質(zhì)量范圍,可以對未知的甜菊糖苷類化合物實(shí)現(xiàn)非靶標(biāo)的篩查。在實(shí)際掃描過程中,當(dāng)一級全掃描發(fā)現(xiàn)目標(biāo)列表里的分子離子且信號強(qiáng)度超過預(yù)設(shè)值后,就會觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴子離子掃描模式,進(jìn)而獲得對應(yīng)分子離子精確質(zhì)量數(shù)的二級離子全掃描質(zhì)譜信息,以實(shí)現(xiàn)定性確證。使用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜對實(shí)驗(yàn)室已有的8種甜菊糖苷類化合物進(jìn)行分析,色譜圖見圖1。

2.2 靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

本研究也比較了使用四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜對目前可以通過商業(yè)化的方式購得的甜菊糖苷類化合物純品進(jìn)行母離子定量、子離子定量以及樣品基質(zhì)定量結(jié)果的影響。結(jié)果表明,8種甜菊糖苷使用母離子定量時的線性關(guān)系要優(yōu)于子離子定量的線性關(guān)系,在使用母離子定量時,8種甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)r2≥0.995)。

過在沒有經(jīng)過稀釋的白酒和飲料中準(zhǔn)確加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成50 μg/L的加標(biāo)樣品,進(jìn)行回收率分析,以考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,對于飲料樣品,基質(zhì)干擾較少,回收率大于95%,但是白酒樣品特別是醬香型白酒樣品受樣品基體的影響比較大,回收率低于60%(40%～60%)。

為消除白酒基質(zhì)對甜菊糖苷類化合物定量的干擾,本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行校正,分別考察了未稀釋、稀釋5倍、稀釋10倍后白酒樣品加標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系。結(jié)果表明,未稀釋白酒樣品部分化合物在10～1 000 μg/L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)小于0.99,稀釋5倍或是10倍后的白酒樣品相關(guān)系數(shù)均大于0.995?？紤]到稀釋倍數(shù)會影響方法的檢出限,最終選擇稀釋5倍的白酒作基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線,在此條件下測得的線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表2。逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,并對有信號檢出的最低濃度加標(biāo)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次,用3次響應(yīng)的信噪比(S/N)均大于3和10來確定檢出限和定量限,結(jié)果見表2。

回收率的檢測為在白酒樣品中準(zhǔn)確加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用流動相稀釋5倍,配制成4個水平(50、100、250、500 μg/kg)的加標(biāo)樣品,每個水平進(jìn)行3次平行分析。8種甜味劑在線性范圍內(nèi)的平均加標(biāo)回收率為81.9%～106%, RSD<10%,精密度良好(見表3)。

表 2 8種甜菊糖苷的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the eight steviol glycosides

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 3 白酒中8種甜菊糖苷的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the eight steviol glycosides in wines (n=3)

-: not detected.

圖 2 4種典型甜菊苷類化合物的二級碎片離子譜Fig. 2 Secondary fragment ion spectra of the four typical steviol glycoside compounds

2.3 甜菊糖苷類化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律

如Molina-Calle[12,14]所報(bào)道,甜菊糖苷類甜味劑屬于四環(huán)二萜糖苷,這類甜味劑的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)為內(nèi)-貝殼杉烯酸(ent-kaurenoic acid)經(jīng)羥基化后生成的甜菊醇,分子式為C20H30O3,精確相對分子質(zhì)量為318.219 5。在甜菊醇的C-19和C-13兩個不同位置的碳上接上不同數(shù)量的葡萄糖基、木糖基和鼠李糖基,就形成各種不同的甜菊糖苷類甜味劑[15]。據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道,目前從甜葉菊中分離純化的甜菊糖苷類甜味劑達(dá)30種以上,這些甜味劑由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)品,無法通過傳統(tǒng)的方法得到識別和檢測?；趶母叻直尜|(zhì)譜獲取的8種甜菊糖苷類化合物的二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)信息(見表4和圖2),對甜菊糖苷類化合物的裂解規(guī)律進(jìn)行了分析。從表4可以看出,甜菊糖苷類化合物的二級碎片離子質(zhì)譜圖中存在m/z479.265 0和317.211 9兩個共性特征碎片離子,根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)可以推斷,m/z317.211 9為甜菊醇分子離子峰,m/z479.265 0則是內(nèi)-貝殼杉烯-葡萄糖碎片離子。其余二級碎片離子則是內(nèi)-貝殼杉烯-葡萄糖基結(jié)合了別的單糖(包括葡萄糖基、鼠李糖基和木糖基,m/z641.316 3、625.322 1和611.306 4)而構(gòu)成。對比各種甜菊糖苷類化合物的二級碎片離子可以看出,對于甜菊醇的C-19和C-13兩個糖苷化位點(diǎn)來說,由于所有化合物在二級碎片離子譜中均看不到單獨(dú)丟失鼠李糖基和木糖基的碎片離子,所以可推斷C-19位更容易發(fā)生裂解,最終推斷出甜菊糖苷類化合物的裂解規(guī)律見圖3。

2.4 實(shí)際樣品測定

采集北京地區(qū)市售的7份飲料樣品和5份白酒樣品進(jìn)行檢測。白酒樣品中未檢出甜味劑,飲料樣品中檢出4種天然甜味劑(甜菊苷、甜菊雙糖苷、瑞鮑迪苷A和瑞鮑迪苷C),含量未超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)。此外,使用full MS/dd-MS2模式對于未有甜味劑檢出的白酒樣品中所有化合物進(jìn)行碰撞裂解和二級碎片離子全掃描,并使用本研究發(fā)現(xiàn)的m/z479.265 0和317.211 9標(biāo)識性碎片離子進(jìn)行提取,未見到明顯色譜峰。

表 4 8種甜菊糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)及二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)Table 4 Chemical structures and accurate masses of secondary fragment ions of the eight steviol glycosides

R1: functional group at C-19 unit; R2: functional group at C-13 unit; Nos. 1-20: serial number of carbon unit in steviol glycosides. Glc: glucose (-C6H11O6); Rha: rhamnose (-C6H11O5); Xyl: xylose (-C5H9O5).

圖 3 甜菊糖苷類化合物質(zhì)譜裂解途徑Fig. 3 Mass spectrometry fragment pathways of steviol glycoside compounds dR1: disrupt R1 functional group; dR2: disrupt R2 functional group; dGlc: disrupt glucose functional group.

3 結(jié)論

采用親水作用液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù),建立了食品中甜菊糖苷類甜味劑快速精準(zhǔn)篩查方法,與目前所報(bào)道的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比,本方法不僅靈敏度同樣滿足標(biāo)準(zhǔn)要求,而且不需要標(biāo)準(zhǔn)品即可對樣品中是否有菊糖苷進(jìn)行快速和精準(zhǔn)定性。同時,通過研究甜菊糖苷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,鑒定出2個甜菊糖苷類化合物的標(biāo)識性碎片離子,實(shí)現(xiàn)了食品中未知甜菊糖苷類化合物的非靶標(biāo)篩查。