沈偉健, 吳 斌, 王 紅, 王曉研, 余可垚, 陸慧媛, 胡國紳, 李靜靜

(南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心, 江蘇 南京 210019)

在新農(nóng)藥開發(fā)領(lǐng)域,含氮雜環(huán)化合物已經(jīng)成為主流方向。近十年開發(fā)的新化學(xué)農(nóng)藥中,有70%左右的品種為含氮雜環(huán)化合物,其中吡唑類農(nóng)藥是一類較為重要的農(nóng)藥,共有30多個(gè)含吡唑結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥,國內(nèi)上市的有23個(gè)。?；吝蝾愞r(nóng)藥在吡唑類農(nóng)藥中占據(jù)非常重要的地位,目前有2類,一類是4-位酰胺基吡唑類殺菌劑,其中的氨基多為苯環(huán)或雜環(huán)取代,且以雜環(huán)取代時(shí)活性更高,主要有呋吡菌胺(furametpyr)、吡噻菌胺(penthiopyrad)和氟唑菌苯胺(penflufen)3種;另一類是4-位芳?；吝蝾惓輨?結(jié)構(gòu)中4-位上都是苯甲酰基,且苯環(huán)上含有多個(gè)取代基團(tuán),主要有吡唑特(pyrazolynate)和芐草唑(pyrazoxyfen)兩種。國外對(duì)食品中酰基吡唑類農(nóng)藥殘留有較為嚴(yán)格的限制,例如日本肯定列表中明確規(guī)定芝麻籽或其他堅(jiān)果類農(nóng)產(chǎn)品中呋吡菌胺和吡唑特的最大殘留限量分別為0.1和0.02 mg/kg。

目前針對(duì)吡唑類農(nóng)殘檢測(cè)的國內(nèi)外文獻(xiàn)多數(shù)集中于單殘留或少數(shù)幾種相關(guān)目標(biāo)物的檢測(cè)[1-12],尚無專門針對(duì)多種?；吝蝾愞r(nóng)殘檢測(cè)的報(bào)道。這些文獻(xiàn)多數(shù)采用氣相色譜-電子捕獲(GC-ECD)技術(shù)[1]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)[2-7]或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)[7-12]進(jìn)行分析測(cè)定。其中,LC-MS/MS在分析吡唑類農(nóng)藥時(shí),靈敏度較高,選擇性也較好,但是儀器及運(yùn)行成本較高,不易推廣。而氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法中最常用的離子源技術(shù)是電子轟擊(EI)離子化技術(shù),這種技術(shù)在分析諸如食用植物油等基體復(fù)雜的“問題”基質(zhì)時(shí),干擾現(xiàn)象非常普遍,為了解決干擾問題和降低儀器維護(hù)成本,需要對(duì)樣品進(jìn)行嚴(yán)格而繁瑣的凈化過程[4-7]。化學(xué)電離(CI)離子化技術(shù)相對(duì)于EI而言,屬于軟電離技術(shù),離子碎裂較少,容易得到相對(duì)分子質(zhì)量信息。根據(jù)極性的不同又分為正化學(xué)電離(PCI)和負(fù)化學(xué)電離(NCI),其中PCI技術(shù)由于對(duì)農(nóng)藥等目標(biāo)物的質(zhì)子親和力比復(fù)雜基質(zhì)的基體成分及柱流失要高些,因此干擾現(xiàn)象相對(duì)要少得多,但總體靈敏度和EI基本相當(dāng)[13-15]。NCI技術(shù)一方面對(duì)含電負(fù)性元素或基團(tuán)的化合物有特殊性響應(yīng),而對(duì)基質(zhì)成分和柱流失分別沒有響應(yīng)和響應(yīng)極低,具有強(qiáng)抗干擾能力;另一方面,目標(biāo)物的電負(fù)性越強(qiáng),NCI的響應(yīng)也越高,因此近些年NCI在農(nóng)藥殘留等領(lǐng)域的應(yīng)用研究得到持續(xù)關(guān)注[2,3]?？紤]到食用植物油基質(zhì)的復(fù)雜性和5種?；吝蝾惔郎y(cè)農(nóng)藥分子中均帶有強(qiáng)電負(fù)性的鹵族元素(氟或氯),選用高選擇性、高靈敏度的NCI-GC-MS技術(shù)分析,應(yīng)該是較好的選擇。因此本文采用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合NCI-GC-MS檢測(cè)技術(shù)測(cè)定了食用植物油中5種酰基吡唑類農(nóng)藥的殘留量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682中一級(jí)水要求,乙腈有色譜純和分析純2種試劑,其他試劑均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)品:呋吡菌胺(furametpyr, CAS號(hào):123572-88-3)、吡噻菌胺(penthiopyrad, CAS號(hào):183675-82-3)、氟唑菌苯胺(penflufen, CAS號(hào):494793-67-8)、吡唑特(pyrazolynate, CAS號(hào):58011-68-0)、芐草唑(pyrazoxyfen, CAS號(hào):71561-11-0)、純度均≥98%,均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與材料

Agilent 7890A氣相色譜-5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀(配備有CI離子源,美國安捷倫公司)。ST16離心機(jī)(美國ThermoFisher公司), WH-3旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)。BUCHI R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI有限公司)。超聲波振蕩器(KH5200B,昆山禾創(chuàng)超聲儀器廠), EVA32全自動(dòng)氮吹濃縮儀(普立泰科儀器有限公司)。50 mL雞心瓶,50 mL塑料具塞離心管。

PestiCard石墨化炭黑(GCB)填料(120～140目,賽分科技有限公司),乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)填料(40～60目,北京艾杰爾科技有限責(zé)任公司), C18(碳載量17%)填料(40～60目,北京艾杰爾科技有限責(zé)任公司)。

試驗(yàn)用到的橄欖油、芝麻油、大豆油、菜籽油、花生油、葵花籽油和玉米油等樣本均為南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心食品實(shí)驗(yàn)室提供的送檢樣品,并儲(chǔ)藏于實(shí)驗(yàn)室冷藏室中備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取10 mg 5種?；吝蝾愞r(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中,用色譜純乙腈溶解并定容至刻度線,配制成1.0 g/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存,有效期為6個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別準(zhǔn)確移取5種?；吝蝾愞r(nóng)藥單標(biāo)儲(chǔ)備液1 mL于同一個(gè)容量瓶中,用色譜純乙腈稀釋至刻度線,配制成100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,臨用時(shí)用色譜純乙腈稀釋為10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存,有效期為3個(gè)月。 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:陰性植物油樣品經(jīng)提取凈化后得到基質(zhì)溶液,將5種酰基吡唑類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1 000、500、200、100、50和20 μg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 提取

準(zhǔn)確稱取10 g(精確至0.01 g)食用油樣品于50 mL塑料離心管中,加入20 mL分析純乙腈,渦旋混合均勻,加入5 g氯化鈉,采用超聲波振蕩器提取15 min,放入離心機(jī)中8 000 r/min下離心3 min,取上層清液至雞心瓶中。放置于-18 ℃冰箱中冷凍保存1 h,取出雞心瓶后迅速用濾紙濾去凝固的脂肪。殘?jiān)捎猛瑯拥姆椒ㄌ崛∫淮?合并兩次的提取液于40 ℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。雞心瓶中加入2.0 mL分析純乙腈溶解殘?jiān)?渦旋1 min,待凈化。

1.5 QuEChERS凈化

將待凈化提取液移入玻璃試管中,加入100 mg PSA、50 mg石墨化炭黑、200 mg C18,高速渦旋1 min,過0.22 μm有機(jī)相濾膜至進(jìn)樣小瓶,待GC-NCI-MS檢測(cè)分析。

1.6 儀器分析

1.6.1色譜條件

色譜柱:HP-5MS UI柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:初始溫度100 ℃(保持4.5 min),以20 ℃/min升至300 ℃,保持4.5 min;載氣:高純氦氣(≥99.999%);載氣流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:1 μL;進(jìn)樣模式:脈沖不分流進(jìn)樣(脈沖壓力275 kPa), 1.50 min后打開分流閥;進(jìn)樣口溫度:300 ℃;傳輸線溫度:280 ℃。

1.6.2質(zhì)譜條件

離子源溫度:150 ℃;四極桿溫度:150 ℃;電離模式:負(fù)化學(xué)離子源;電子能量:經(jīng)自動(dòng)調(diào)諧后得到的電子能量;溶劑延遲時(shí)間:8.00 min;反應(yīng)氣:高純甲烷氣(≥99.999%);數(shù)據(jù)采集模式:分時(shí)段選擇離子監(jiān)測(cè)模式(SIM),具體參見表1。

表 1 ?；吝蝾愞r(nóng)藥的保留時(shí)間、保留時(shí)間窗口、定量及定性離子、線性方程和定量限Table 1 Retention times (RTs), RT windows, quantitative ions, qualitative ions, linear equations, and limits of quantification (LOQs) of acylpyrazole pesticides

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

圖 1 (a)陰性橄欖油基質(zhì)及(b)陰性橄欖油基質(zhì)加標(biāo) 溶液(0.1 mg/L)的總離子流圖Fig. 1 TIC chromatograms of (a) a negative olive oil matrix and (b) a negative olive oil matrix spiked with mixed standard solution (0.1 mg/L)

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器方法的選擇

如表1所示,由于所分析的5種?；吝蝾愞r(nóng)藥的分子結(jié)構(gòu)中均含有若干個(gè)氟原子或氯原子,分子具有較強(qiáng)的電負(fù)性,因此選用對(duì)含電負(fù)性基團(tuán)或元素有特異性響應(yīng)的NCI技術(shù)進(jìn)行測(cè)定,顯然應(yīng)該是較好的選擇,如沈偉健等[2]和陳珊珊等[3]就是采用NCI技術(shù)對(duì)含多個(gè)氟原子的氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行分析測(cè)定,選擇性和靈敏度都較好。

將陰性食用油樣本經(jīng)過前述的提取凈化前處理后,得到的總離子流色譜圖比較平坦,近乎走空針,見圖1a。采用陰性橄欖油作為基質(zhì),進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)得到的總離子流圖見圖1b,可以看出5種?；吝蝾愞r(nóng)藥均得到了較好的分離且無干擾,因此本文選擇GC-NCI-MS技術(shù)進(jìn)行分析。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1提取步驟的優(yōu)化

通常情況下食用植物油脂類物質(zhì)熔點(diǎn)較低,因此可以利用熔點(diǎn)上的差別實(shí)現(xiàn)待分析物和植物油脂類物質(zhì)的分離。實(shí)驗(yàn)中采用冷凍的方法可以較為有效地將脂類物質(zhì)從提取溶液中分離出去。將乙腈提取液放置于-18 ℃冰箱中冷凍1 h后,雞心瓶內(nèi)壁上凝結(jié)著大量脂類物質(zhì),而目標(biāo)物依舊溶解在低溫的乙腈中,使用濾紙快速過濾,可以有效去除析出的固體脂類物質(zhì)。

2.2.2凈化過程的優(yōu)化

本方法凈化步驟采用經(jīng)典的分散固相萃取技術(shù)(QuEChERS),其原理簡單,操作方便,試劑耗材消耗小,對(duì)環(huán)境友好,速度快,效率高,一天一人能完成100個(gè)以上樣本的前處理。

方法對(duì)3種填料(PSA、石墨化炭黑和C18)的使用量(分50 mg、100 mg、150 mg、200 mg等4個(gè)使用量)進(jìn)行了正交試驗(yàn),綜合考慮了回收率、凈化效果、基質(zhì)效應(yīng)、儀器維護(hù)保養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)效益等因素,最終確定每種填料的使用量分別為PSA 100 mg、石墨化炭黑50 mg、C18200 mg。

基質(zhì)效應(yīng)普遍存在于質(zhì)譜分析中,其存在通常會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),部分目標(biāo)物的回收率超過130%,顯示出一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。因此為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,實(shí)驗(yàn)中采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量,在一定程度上控制了基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

采用陰性橄欖油、芝麻油兩種典型食用植物油作為研究對(duì)象,經(jīng)過前述完全相同的提取、凈化和濃縮等前處理后用提取溶劑進(jìn)行稀釋,得到基質(zhì)溶液(最終確保每毫升基質(zhì)溶液中含有基質(zhì)的質(zhì)量濃度與實(shí)際檢測(cè)樣品溶液相同)。再用基質(zhì)溶液稀釋配制得到的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,在20～1 000 μg/L范圍內(nèi),以定量離子峰面積Y為縱坐標(biāo),工作溶液濃度X(μg/L)為橫坐標(biāo),繪制6點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,所有目標(biāo)物均呈現(xiàn)了良好的線性,相關(guān)系數(shù)均大于0.993 0;根據(jù)定量限信噪比(S/N)=10得到目標(biāo)物的定量限,線性方程及定量限見表1。

由表1定量限數(shù)據(jù)可知,本方法靈敏度較高,所有目標(biāo)物的方法定量限均不高于2 μg/kg,完全滿足國際國內(nèi)相關(guān)法規(guī)(GB 2763-2016與日本肯定列表)的限量要求。

2.3.2方法的準(zhǔn)確度及精密度

選取陰性橄欖油、芝麻油樣品做添加回收試驗(yàn),3個(gè)添加水平分別為0.01、0.02、0.05 mg/kg,每個(gè)添加水平做6個(gè)平行樣,分別計(jì)算平均回收率及其RSD,結(jié)果見表2?？梢钥闯?3個(gè)添加水平下,2種不同基質(zhì)中5種?；吝蝾愞r(nóng)藥的平均回收率均處于82.7%～112.4%之間,所有RSD均≤12.3%。說明方法的準(zhǔn)確度是可靠的,精密度也是穩(wěn)定的。

表 2 農(nóng)藥在2種食用植物油中3個(gè)添加水平下的平均回收率及其RSD (n=6)Table 2 Average recoveries and RSDs of the pesticides at three spiked levels in two vegetable oils (n=6)

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)室自建立食用植物油中5種?；吝蝾愞r(nóng)藥殘留量的檢測(cè)方法以來(2018年初),已完成近500個(gè)各種常見食用植物油樣品的檢測(cè),其中有9個(gè)樣品(均為大豆油)中檢測(cè)出氟唑菌苯胺,但均未超過日本肯定列表一律標(biāo)準(zhǔn)中的限量值,其中檢出的氟唑菌苯胺殘留量分別為0.6、0.9、1.4、1.6、2.5、2.6、2.6、3.6、3.8 μg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了GC-NCI-MS技術(shù)測(cè)定食用植物油中5種酰基吡唑類農(nóng)藥殘留量的方法。該法靈敏度高,定量限均低于2 μg/kg,可用于測(cè)定食用植物油中5種酰基吡唑類農(nóng)藥的殘留量。