邱麗紅，羅文英

腸道病毒71型感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

邱麗紅，羅文英

524001 湛江，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

腸道病毒 71（enterovirus 71，EV71）是一種具有潛在致命性和破壞性的嗜神經(jīng)細(xì)胞病毒，可能是新型小兒麻痹癥的致病因素，局灶性癱瘓與受累的腦干灰質(zhì)或脊髓有關(guān)[1]。EV71 感染引起的手足口病、皰疹和相關(guān)并發(fā)癥的嚴(yán)重兒科病例和較高死亡病例在亞洲帶來(lái)了巨大的公共衛(wèi)生影響[2]。目前，EV71 疫苗已被批準(zhǔn)用于手足口病預(yù)防，但仍面臨各種 EV71 大流行毒株的適用性、疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量控制的國(guó)際要求、不同病原體監(jiān)測(cè)和檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題[3]。然而，由于基因組突變率高，對(duì) EV71 感染引起嚴(yán)重的腦和肺并發(fā)癥甚至死亡的潛在機(jī)制尚不清楚，目前尚無(wú)針對(duì)手足口病患者的特異性抗病毒治療方法。因此，EV71 感染的發(fā)病機(jī)制受到了醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域廣泛的重視。細(xì)胞程序性死亡通常是在病毒感染期間由宿主免疫反應(yīng)引起的，通過(guò)干擾病毒繁殖的環(huán)境，從而限制病毒的傳播[4]。細(xì)胞凋亡可以由細(xì)胞外源性途徑（由死亡受體介導(dǎo)）和細(xì)胞內(nèi)源性途徑（線粒體）引發(fā)，這兩種途徑最終導(dǎo)致效應(yīng)子半胱天冬酶（caspase）3、6 和 7的活化，也可以由細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞引發(fā)遞送顆粒酶類激活凋亡的 caspase[5]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在 EV71 感染宿主細(xì)胞導(dǎo)致手足口病及并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用，為闡明 EV71 的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。本文主要從 EV71 感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路方面討論手足口病的致病機(jī)制。

1 細(xì)胞凋亡在 EV71 感染中的作用

細(xì)胞凋亡是發(fā)生在多種病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染和多種人類神經(jīng)退行性疾病過(guò)程中的一個(gè)普遍而廣泛的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，可通過(guò)內(nèi)源性或外源性途徑發(fā)生，對(duì)病毒感染宿主具有預(yù)防病毒進(jìn)一步傳播、潛在抑制和解決炎癥過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)[6]。細(xì)胞凋亡通過(guò)促進(jìn)移除不需要的、受損的或感染的細(xì)胞從而在保持體內(nèi)平衡、發(fā)育和人類疾病中起重要作用，然而也可能通過(guò)促成細(xì)胞死亡和組織損傷而具有致病作用。細(xì)胞凋亡發(fā)生在廣泛的人類病毒感染中，包括感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和肝臟[7]。病毒通過(guò)與宿主共存已經(jīng)進(jìn)化到能夠利用它們?nèi)肭旨?xì)胞的基本功能，如內(nèi)吞、分泌、細(xì)胞分裂和凋亡，利用多種機(jī)制逃避或破壞細(xì)胞凋亡，包括凋亡傳感器失活、凋亡調(diào)節(jié)因子的分子模擬和 caspase 裂解的擾動(dòng)，可以通過(guò)干擾凋亡識(shí)別和清除機(jī)制來(lái)達(dá)到自己的目的[8]。通過(guò)清除有害細(xì)胞，抑制免疫反應(yīng)，保證發(fā)育過(guò)程中正常組織和器官的形成，凋亡細(xì)胞的清除在所有多細(xì)胞生物中都起著重要的作用。在 EV71 感染細(xì)胞誘導(dǎo)新的 RNA 顆粒的形成過(guò)程中，抗病毒 RNA 顆粒的經(jīng)典應(yīng)激顆粒形成受抑制，其可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制 EV71 的傳播[9]。細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度不僅與病毒滴度的升高有關(guān)，而且凋亡通常發(fā)生在病毒感染的解剖部位，動(dòng)物模型也揭示了細(xì)胞凋亡與疾病嚴(yán)重程度的正相關(guān)關(guān)系，提示細(xì)胞凋亡是病毒誘導(dǎo)疾病的發(fā)病機(jī)制[7]。

許多病毒都有細(xì)胞凋亡抑制基因，一旦在感染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)就可以在病毒繁殖期避免誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，另一方面病毒可以利用刺激細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)脫落和傳播，防止感染細(xì)胞向免疫系統(tǒng)提供病毒抗原和殺死未感染的限制病毒傳播的免疫細(xì)胞[10]。感染宿主細(xì)胞是否經(jīng)歷凋亡取決于病毒類型、致病性和抵抗感染細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)或逃避免疫細(xì)胞的任何攻擊的能力。因此，病毒基因組在整個(gè)進(jìn)化過(guò)程中得到了適應(yīng)，滿足特定病毒在其生命周期中誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡的需要。

2 EV71 感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路

2.1 外源性途徑

外源性細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞外微環(huán)境擾動(dòng)引發(fā)的調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的模式，主要由兩種類型驅(qū)動(dòng)質(zhì)膜受體：①死亡受體，其中激活取決于同源配體的結(jié)合，包括 Fas 細(xì)胞表面死亡受體和 TNF 受體超家族成員；②依賴性受體，其活化發(fā)生在其特定配體的水平降至特定的水平以下時(shí)。依賴受體家族包括大約 20 名成員，包括軸突生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體酪氨酸激酶 3 和音猬受體修補(bǔ) 1[11]。病毒感染可引發(fā)外源性死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在病毒發(fā)病機(jī)制和宿主抗病毒反應(yīng)起著重要作用，通過(guò)協(xié)助持續(xù)的病毒感染或者引起宿主消除受感染的細(xì)胞，病毒編碼的基因產(chǎn)物，抑制死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和逃避宿主免疫反應(yīng)[12]。EV71 感染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞（human rhabdomyosarcoma cells，RD）顯著增強(qiáng) FasL 和 caspase-3 的表達(dá)，進(jìn)一步激活Fas/FasL 介導(dǎo)的凋亡途徑，而黃芩苷處理后的 EV71 感染的 RD 細(xì)胞中 FasL 的表達(dá)受到抑制，說(shuō)明黃芩苷可有效抑制 EV71 感染的 RD 細(xì)胞的凋亡[13]。EV71 病毒 2C 蛋白阻止 TNF-α 誘導(dǎo)的 NF-κB 激活，揭示了 EV71 抑制抗病毒免疫應(yīng)答的一種潛在機(jī)制[14]。HT-29 細(xì)胞在 EV71 感染中發(fā)生凋亡，但 ERK1/2 和 JNK1/2 信號(hào)的激活似乎抑制了 TNF-α 和 FasL 的誘導(dǎo)，并抑制了感染細(xì)胞的外源性細(xì)胞凋亡[15]。目前的數(shù)據(jù)表明，在 EV71 誘導(dǎo)的手足口病的發(fā)展過(guò)程中，TLR3 和 Notch 信號(hào)的相互作用調(diào)節(jié) CD14 單核細(xì)胞功能和炎癥反應(yīng)[16]。EV71 感染的細(xì)胞中 NEDD4L 和 PSMF1 的水平分別增加和降低，NEDD4L 的消耗顯著降低了 EV71 的復(fù)制，而PSMF1 敲低增強(qiáng)了 EV71 的復(fù)制，提示宿主蛋白 NEDD4L在該病毒復(fù)制中的新作用[17]。

2.2 內(nèi)源性途徑

內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑由廣泛的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激條件引發(fā)，包括細(xì)胞因子剝奪、DNA 損傷、氧化應(yīng)激、細(xì)胞溶質(zhì) Ca2+超載和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這些異常的凋亡信號(hào)通過(guò)觸發(fā)線粒體外膜透化，促進(jìn)細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）和其他線粒體因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，最終導(dǎo)致激發(fā)劑和效應(yīng) caspase 的產(chǎn)生以及隨后的細(xì)胞死亡[12]。B 細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）家族的成員是線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵仲裁者。Bcl-2 失調(diào)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是許多疾病的基礎(chǔ)，許多病毒 Bcl-2 的同源物可以破壞宿主細(xì)胞的凋亡和自噬，防止被感染的細(xì)胞過(guò)早死亡[18]。無(wú)論是感染 EV71 還是表達(dá) EV71 2B 蛋白的細(xì)胞，其凋亡在 Bax 敲除細(xì)胞中均顯著減少，而在 Bak 敲除細(xì)胞中則沒(méi)有出現(xiàn)顯著減少，重組 Bax 處理后從表達(dá) 2B 的細(xì)胞中分離出的線粒體顯示 Bax 相互作用增強(qiáng)，Cyt C 釋放增加，抗凋亡蛋白 Bcl-X 的過(guò)表達(dá)消除了 2B 誘導(dǎo)的 Cyt C 釋放和caspase 活化，表明 EV71 2B 蛋白通過(guò)直接調(diào)節(jié)促凋亡蛋白 Bax 的重新分布和活化來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并影響線粒體凋亡途徑，揭示了在 EV71 感染期間 Cyt C 釋放和線粒體通透性機(jī)制的重要線索[19]。EV71 通過(guò)非結(jié)構(gòu)病毒蛋白 3C 激活 caspase-3 誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，3C蛋白結(jié)合 caspase-8 和 caspase-9，但并不直接結(jié)合 caspase-3，抑制 caspase-3 活性可減弱細(xì)胞凋亡和降低 EV71 病毒蛋白的表達(dá)和病毒產(chǎn)量，但對(duì)病毒進(jìn)入、復(fù)制甚至多蛋白翻譯無(wú)明顯影響[20]。在 EV71 感染期間經(jīng)常誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以抑制病毒復(fù)制，同時(shí)利用抗細(xì)胞凋亡途徑如 PI3K/Akt 途徑來(lái)完成病毒生命周期，在 EV71 感染期間通過(guò)磷酸化和滅活 ASK1 來(lái)激活 PI3K/Akt 途徑限制 JNK 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21]。在 EV71 感染期間，凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）被截?cái)嗖木€粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，伴隨著 Cyt C 的釋放，線粒體膜電位急劇下降，AIF 敲除對(duì)凋亡細(xì)胞的死亡具有顯著的保護(hù)作用，添加泛 caspase 抑制劑可以提供更大的保護(hù)作用[22]。

2.3 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一系列細(xì)胞功能發(fā)生的一種真核細(xì)胞器，包括運(yùn)輸細(xì)胞材料、提供增加的表面細(xì)胞反應(yīng)區(qū)域和蛋白質(zhì)、類固醇和脂質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是表示各種刺激影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能途徑的總稱，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)一種進(jìn)化上保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，即未折疊蛋白反應(yīng)，其目的是削弱刺激，并根據(jù)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)情況決定細(xì)胞存活還是凋亡[23]。EV71 感染 RD 細(xì)胞引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)伴侶蛋白、BiP 和鈣網(wǎng)蛋白的過(guò)度表達(dá)以及 eIF2α 的磷酸化，但紫外線滅活病毒的感染沒(méi)有觀察到相似現(xiàn)象，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由病毒復(fù)制而非病毒附著或進(jìn)入導(dǎo)致[24]。EV71 感染可以誘導(dǎo)同型半胱氨酸誘導(dǎo)的 ER 蛋白（HERP），它是應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑并依賴于 MAVS 的參與，證明 EV71 誘導(dǎo)的 HERP 通過(guò)促進(jìn) I 型 IFN（IFN-α 和 IFN-b）和 III 型表達(dá)刺激宿主先天免疫以抑制病毒復(fù)制，HERP 通過(guò)與 TANK 結(jié)合激酶 1 的相互作用擴(kuò)增 MAVS 信號(hào)傳導(dǎo)并促進(jìn) IFN 調(diào)節(jié)因子 3、NF-κB 的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，可增強(qiáng) IFNs 的表達(dá)，抑制 RNA 病毒的廣泛復(fù)制[25]。GRP78/BiP 是一種 ER 伴侶蛋白，具有維持 ER 穩(wěn)態(tài)的重要功能，過(guò)表達(dá)可減輕 ER 應(yīng)激，EV71 感染可誘導(dǎo) GRP78/BiP 上調(diào)，而 ER 中 GRP78/BiP 過(guò)表達(dá)下調(diào)病毒復(fù)制和病毒顆粒形成[26]。EV71 感染上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子 X-盒結(jié)合蛋白 1（XBP1）mRNA 水平，但未激活剪接的XBP1smRNA 或其下游靶基因，EDEM 和伴侶蛋白、病毒蛋白在敲除 XBP1 后表達(dá)增加。EV71 病毒蛋白的合成和 EV71 產(chǎn)生的病毒顆粒在過(guò)表達(dá) XBP1 的 RD 細(xì)胞中受到抑制，而肌醇需求酶 1 通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)下游 XBP1，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[27]。

2.4 穿孔素/顆粒酶凋亡信號(hào)通路

細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞包括細(xì)胞毒 T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK），激活并識(shí)別目標(biāo)介導(dǎo)靶細(xì)胞死亡的保守途徑，細(xì)胞分泌毒顆粒至免疫突觸并釋放大量致命的蛋白質(zhì)，包括穿孔蛋白、顆粒酶和顆粒溶蛋白[28]。缺乏 CD4+T 細(xì)胞的小鼠作為野生型小鼠對(duì) EV71 感染具有抗性，而缺乏 B 細(xì)胞的小鼠對(duì)病毒感染高度敏感，其他免疫細(xì)胞對(duì)CD4+T 細(xì)胞功能的補(bǔ)償不太可能，因?yàn)楹谋M CD4+T 細(xì)胞的野生型小鼠也對(duì)病毒感染具有抗性[29]。細(xì)胞毒性 CD8+T 淋巴細(xì)胞有效控制急性病毒感染，但在慢性感染發(fā)展時(shí)可能會(huì)耗盡，病毒特異性 CD8+T 細(xì)胞在 PD-1/PD-L1 途徑的控制下同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)顆粒酶，可以更好地了解急性病毒感染期間抗病毒細(xì)胞毒性免疫的發(fā)展[30]。NK 細(xì)胞是具有免疫監(jiān)視的先天性淋巴細(xì)胞，在沒(méi)有致敏的情況下識(shí)別和消除轉(zhuǎn)化細(xì)胞、病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物病原體感染的細(xì)胞。NK 細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，包括 IFN-γ、TNF-α/β、CD95/FasL 和 TRAIL，以及含有穿孔素、顆粒溶素和顆粒酶 A 和 B 的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞毒性顆粒[31]。自然殺傷 T（iNKT）細(xì)胞的缺乏以及免疫系統(tǒng)的不成熟與新生小鼠對(duì) EV71 感染的易感性有關(guān)，在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)完全成熟之前，iNKT 細(xì)胞是保護(hù)年輕小鼠免受EV71 感染的重要抗病毒效應(yīng)細(xì)胞。有研究證實(shí) EV71 感染通過(guò) TLR3 的信號(hào)傳導(dǎo)活化 iNKT 細(xì)胞[32]。EV71 感染肺水腫（pulmonary Edema，PE）患者具有較低的循環(huán) CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，IL-10、IL-13 和干擾素 IFN-γ 水平顯著升高，廣泛的外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)可能是 PE 的發(fā)病原因[33]。

3 抗細(xì)胞凋亡藥物的研究

槲皮素可有效預(yù)防 EV71 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，對(duì)宿主細(xì)胞毒性低，可能以多種方式阻止病毒感染，抑制 EV713C 蛋白活性從而阻斷 EV71 復(fù)制，對(duì) EV71 具有一定的預(yù)防和強(qiáng)效治療作用[34]。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯是一種抗氧化劑，通過(guò)調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)來(lái)抑制柯薩奇病毒 B 的復(fù)制，對(duì) EV71 感染早期誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也有顯著的抑制作用[35]。茵陳主要通過(guò)抑制病毒內(nèi)化而具有抗 EV71 活性，對(duì)病毒附著、VP2 翻譯和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用最小，與其他藥物聯(lián)合治療 EV71 感染會(huì)更好[36]。酸性多糖通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo) IFN-β 表達(dá)，發(fā)現(xiàn) LJ04 多糖具有強(qiáng)大的抗病毒活性[37]。GLSDY 抑制病毒 RNA 復(fù)制、形成病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，可能通過(guò)直接抑制caspase-8 和間接抑制 Bax 來(lái)抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[38]。在 EV71 感染 Vero 細(xì)胞中，姜黃素顯著抑制病毒 RNA 的合成、病毒蛋白的表達(dá)和病毒后代的總體產(chǎn)生，減少了病毒感染引起的活性氧的產(chǎn)生，通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)抑制蛋白質(zhì)降解，激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，在病毒感染的早期階段顯示出抗凋亡活性[39]。芹菜素可通過(guò)抑制病毒 IRES 活性和調(diào)節(jié)細(xì)胞 JNK 途徑來(lái)抑制 EV71 復(fù)制，阻止 EV71 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和細(xì)胞因子的上調(diào)[40]。

4 結(jié)語(yǔ)

EV71 是手足口病的主要病原體之一，常引起嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，死亡率較高。由于 EV71 與宿主細(xì)胞相互作用的具體致病機(jī)制尚未清楚，目前沒(méi)有針對(duì)性的藥物和預(yù)防措施。研究發(fā)現(xiàn) EV71 感染可以通過(guò)多條信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，主要包括內(nèi)源性和外源性途徑，但是還未詳細(xì)闡明信號(hào)通路中相關(guān)分子的相互作用機(jī)制。研究抗細(xì)胞凋亡的藥物主要是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，缺少體內(nèi)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的驗(yàn)證。通過(guò)激活或抑制細(xì)胞凋亡來(lái)控制凋亡程度，從而控制 EV71 感染的發(fā)生發(fā)展，對(duì)預(yù)防和治療重癥手足口病具有重要意義。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.013

國(guó)家自然科學(xué)基金（81301478）；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（B2017055）

羅文英，Email：luo_wenying@126.com

2019-04-22