尤信信，楊爭，劉新光

結(jié)核抗體的研究進(jìn)展

尤信信，楊爭，劉新光

523808 東莞，廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所（尤信信、劉新光）；518020 廣東，深圳市慢性病防治中心（楊爭）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病。雖然近 10 年我國肺結(jié)核患者數(shù)呈緩慢下降趨勢，但是近 5 年發(fā)病死亡率出現(xiàn)急劇回升。造成這種局面的原因首先在于耐藥結(jié)核（DR-TB）、耐多藥結(jié)核（MDR-TB）和廣泛耐藥結(jié)核（XDR-TB）的流行及其比例的上升；其次，近 50 年來抗結(jié)核新藥鳳毛麟角，耐多藥結(jié)核病甚至達(dá)到無藥可用的局面；再次，結(jié)核免疫機(jī)制復(fù)雜，新型高效疫苗的開發(fā)進(jìn)展緩慢。因此，面對嚴(yán)峻的結(jié)核病防控形勢，闡明結(jié)核免疫的關(guān)鍵機(jī)制，開發(fā)抗結(jié)核新藥具有重要意義。除了化學(xué)藥物和抗生素，結(jié)核分枝桿菌特異性抗體被報道具有防止感染、殺滅胞內(nèi)細(xì)菌、降低菌載量、減輕病癥等作用，然而結(jié)核分枝桿菌特異性單克隆抗體的研究比較少見，早期研究者開發(fā)出來的少數(shù)單克隆抗體應(yīng)用效果不佳。由于沒有理想的疫苗，目前控制結(jié)核病的主要策略是早期發(fā)現(xiàn)和早期治療活動性結(jié)核患者。然而，我國已將近 50 年沒有抗結(jié)核新藥批準(zhǔn)上市，鏈霉素（1944 年）、異煙肼（1952 年）、吡嗪酰胺（1954 年）、利福平（1965 年）、乙胺丁醇（1968 年）等抗結(jié)核一線藥物以及一些常用的二線藥物從 20世紀(jì) 60 年代開始一直被使用到現(xiàn)在，加上抗結(jié)核治療療程長、藥物毒副作用大、病人依從性差，相當(dāng)比例的患者（4.6%）因治療失敗而結(jié)核病復(fù)發(fā)，并產(chǎn)生多藥抗性，以致發(fā)展為無藥可用的嚴(yán)重耐多藥結(jié)核和難治性結(jié)核病[1]。雖然 2000 年美國 FDA 批準(zhǔn)的利奈唑胺對耐藥結(jié)核的治療效果顯著，但是其價格昂貴，單藥月費(fèi)用接近 2 萬元，而另一新藥貝達(dá)喹啉在我國仍處于臨床試驗。因此，耐多藥結(jié)核的流行傳播成為嚴(yán)重危害人民健康的重大公共衛(wèi)生問題，有效的結(jié)核菌中和抗體及新型抗結(jié)核藥物的開發(fā)具有重要意義。

1 結(jié)核抗體的殺菌作用

與傳統(tǒng)的抗生素或化療藥物不同，靶向宿主的定向治療（host-directed therapy，HDT）作用于結(jié)核菌抑制或逃避宿主免疫機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，為結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核有效治療提供了新的愿景。在過去的 10 年中，結(jié)核分枝桿菌的宿主免疫機(jī)制研究主要集中在 T 細(xì)胞免疫方面，體液免疫被認(rèn)為是無效或者效率低下而常常被人忽視，特別是 2011 年開始，WHO 不建議用血清抗體檢測法來診斷結(jié)核感染[2]，更加劇了這種不平衡。然而，結(jié)核分枝桿菌特異性抗體并不是無效的。首先，以健康人 IgG 為主要成分的丙球蛋白對結(jié)核患者治療具有顯著效果[3]，而且丙球蛋白在結(jié)核病小鼠模型中能顯著降低肺部菌載量并減輕癥狀[4-6]；其次，隨著單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，TB 特異性抗體被先后開發(fā)出來，并被發(fā)現(xiàn)能顯著降低小鼠肺部活菌量[7-9]。接著，2016 年 10 月，報道 TB 潛伏感染者體內(nèi)的多克隆抗體能有效協(xié)助巨噬細(xì)胞殺滅胞內(nèi)細(xì)菌，控制結(jié)核分枝桿菌的增殖，而活動性結(jié)核患者體內(nèi)的多克隆抗體卻沒有類似功能[10]。Zimmermann 等[11]發(fā)現(xiàn)針對結(jié)核菌 HPHA 的人單克隆 IgA 能有效預(yù)防結(jié)核菌在上皮細(xì)胞的感染和增殖，證實(shí)了結(jié)核分枝桿菌殺菌單克隆抗體的存在。最近，2017 年，Olivares 等[12]發(fā)現(xiàn)血漿 IgG 能顯著增強(qiáng)化療藥物針對耐多藥結(jié)核小鼠模型的治療效果、降低肺部菌載量、減輕肺部病變；而且單獨(dú)使用血漿 IgG 也能顯著降低小鼠肺部菌載量。因此，結(jié)核分枝桿菌特異性的抗體具有防止感染，殺滅胞內(nèi)細(xì)菌，降低菌載量，減輕病癥等作用。雖然結(jié)核抗體并不具備病毒性抗體那樣的完全殺菌作用，但是根據(jù)最近的文獻(xiàn)報道的結(jié)果，我們有理由相信在機(jī)體產(chǎn)生的眾多抗體中，某些針對特定抗原的單克隆抗體具有顯著抑制細(xì)菌感染或促進(jìn)胞內(nèi)細(xì)菌殺滅的作用。由于結(jié)核殺菌抗體的殺菌抑菌機(jī)制與傳統(tǒng)抗結(jié)核治療藥物作用機(jī)制完全不同，不存在交叉耐藥的風(fēng)險，為結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核有效治療提供了新的愿景。隨著體液免疫在結(jié)核病中的重要作用日益凸顯，加上全人源單克隆抗體技術(shù)在其他傳染性疾病中的成熟應(yīng)用，結(jié)核菌殺菌抗體的開發(fā)和研究必將成為一個新的熱潮。

2 結(jié)核抗體的抗結(jié)核作用機(jī)制

抗體在結(jié)核病程中的作用機(jī)制的研究并不多見。有文獻(xiàn)報道：結(jié)核抗體可以有效封閉結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞受體，從而能夠阻止其感染上皮細(xì)胞[11]；抗體通過 Fab 與游離結(jié)核菌結(jié)合，通過細(xì)胞表面的 Fc 受體，促進(jìn)結(jié)核菌的吞噬（ADCP），從而利用細(xì)胞內(nèi)的吞噬溶酶體對結(jié)核菌進(jìn)行降解和殺滅[10]；結(jié)核菌細(xì)胞壁組分能夠進(jìn)入溶酶體胞吐途徑，從而與巨噬細(xì)胞膜融合[13]，完成抗原的表面展示，從而被抗體識別，并通過結(jié)合 FcrRs 激活 NK 細(xì)胞，完成對感染細(xì)胞的殺傷[10]；也有文獻(xiàn)報道結(jié)核抗體隨著菌體進(jìn)入細(xì)胞后，能被細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的受體識別，啟動泛素化途徑對細(xì)菌抗原進(jìn)行降解[14]。此外，潛伏感染者體內(nèi)的抗體能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬溶酶體的成熟以及非焦亡依賴性的炎性小體激活[10]，而炎性小體的激活被證明與細(xì)菌控制緊密相關(guān)[15-17]。再有，我們知道肉芽腫中含有巨噬細(xì)胞等一系列的免疫細(xì)胞[18-19]，功能性抗體的終極作用極有可能是引導(dǎo)巨噬細(xì)胞中細(xì)菌的命運(yùn)并參與局部細(xì)胞微環(huán)境的合作行動。上述研究表明，抗體可能通過多種途徑實(shí)現(xiàn)結(jié)核菌的控制，然而首先，細(xì)菌免疫遠(yuǎn)比病毒免疫復(fù)雜，至今為止沒有找到一條占主導(dǎo)作用的結(jié)核菌體液免疫機(jī)制；其次，上述針對結(jié)核抗體殺菌機(jī)制的研究大多是基于多克隆抗體而進(jìn)行的，其殺菌效果是多種抗體產(chǎn)生的綜合結(jié)果，其對殺菌機(jī)制的解釋仍然缺乏說服力；再次，上述抗體殺菌機(jī)制的研究大多局限于對預(yù)設(shè)通路的驗證，缺乏系統(tǒng)性的研究。抗體識別并殺滅胞內(nèi)結(jié)核菌的機(jī)制，募集良性天然免疫細(xì)胞的功能的研究，特異性結(jié)核菌抗體靶標(biāo)的鑒定都將對抗菌活性研究具有至關(guān)重要的意義。

3 結(jié)核分枝桿菌單克隆抗體

由于多種細(xì)胞受體都可以與結(jié)核分枝桿菌結(jié)合，結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入細(xì)胞的方式多種多樣，因此，結(jié)核分枝桿菌的感染機(jī)制仍不十分明確。即使進(jìn)入吞噬細(xì)胞以后，結(jié)核分枝桿菌還利用眾多的毒力因子來抑制感染細(xì)胞的抗菌機(jī)制，從而為自身的復(fù)制和傳播創(chuàng)造條件。因此，不同于 HIV 和流感分別有 gp120 和 HA 作為既定的中和抗體靶標(biāo)，結(jié)核分枝桿菌的殺菌抗體篩選首先面臨著關(guān)鍵靶標(biāo)的篩選，也正是由于這種靶標(biāo)的不確定性和復(fù)雜性，導(dǎo)致結(jié)核抗體的發(fā)展進(jìn)展緩慢。

過去20 年，雖然陸續(xù)有針對結(jié)核分枝桿菌的單克隆抗體的研究，但并未取得突破性進(jìn)展。已鑒定的功能性單克隆抗體的靶標(biāo)主要包括阿拉伯甘露糖脂（LAM）[9, 11, 20]、肝素連接血凝素（HBHA）[21]、熱激蛋白ACR[7, 22]、細(xì)菌表面脂蛋白 MPB83[8]和分泌型蛋白 MPT51[23]等。然而，這些抗體雖然在體外細(xì)胞實(shí)驗中或小鼠感染模型中具有一定的功效，如降低早期菌載量、減輕肺部病變、延長生存期、抑制感染等，但是這些抗體的保護(hù)效果并沒有達(dá)到預(yù)期。首要原因在于抗體的作用靶標(biāo)可能并不是細(xì)菌感染、復(fù)制和傳播的關(guān)鍵；其次，這些抗體針對靶標(biāo)的親和力并不強(qiáng)，導(dǎo)致其功效受到限制；另外，可能由于結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)制及胞內(nèi)互作機(jī)制的復(fù)雜性，單一靶標(biāo)的抗體功效很難對結(jié)核菌進(jìn)行有效抑制和殺滅。

4 展望

1921 年，卡介疫苗（bacillus Calmette-Guérin，BCG）開始用于嬰幼兒結(jié)核病預(yù)防，該疫苗在結(jié)核領(lǐng)域的主導(dǎo)地位至今都沒有被動搖。然而 BCG 疫苗本身來自牛結(jié)核分枝桿菌，其介導(dǎo)的保護(hù)效果不穩(wěn)定，對不同類型結(jié)核病以及不同人群保護(hù)效應(yīng)也有所不同。另外，在免疫缺陷病人如 HIV 患者其還有可能造成感染風(fēng)險。因此，新型高效結(jié)核疫苗的開發(fā)需求非常迫切。目前正在進(jìn)行的結(jié)核疫苗臨床試驗有 14 個，其中包括全菌滅活疫苗 DAR901（非結(jié)核分枝桿菌來源）[24]、Vaccae（Mycobacterium vaccae）[25]、Mw（Mycobacterium indicuspranii）和 RUTI（Mycobacterium tuberculosis），全菌活疫苗 VPM1002 和 MTBVAC，亞單位疫苗 MVA85A（Ag85A）、H1（Esat-6）、H4（TB10.4 + Ag85B）和 M72（Rv1196 + Rv0125）等。雖然這些疫苗的臨床結(jié)果顯示不同程度的保護(hù)作用，但是目前并沒有一個疫苗的保護(hù)功效超過 BCG。而且目前亞單位疫苗研究也是極具挑戰(zhàn)性，首先，結(jié)核菌沒有明確的感染機(jī)制，從而難以找到關(guān)鍵的抗原分子用于疫苗設(shè)計；其次，目前在研的亞單位疫苗大部分還是以誘導(dǎo) T 細(xì)胞反應(yīng)為主要目標(biāo)，抗體誘導(dǎo)效應(yīng)仍然不被重視。最近幾年，越來越多的研究已證實(shí)結(jié)核桿菌中和抗體和殺傷性抗體的存在。高效的結(jié)核菌亞單位疫苗無疑需要綜合利用機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫。高效殺菌抗體的抗原表位鑒定可能有助于疫苗關(guān)鍵抗原的確定。以體液免疫為基礎(chǔ)，先獲得高效殺菌抗體，然后再確定其殺菌表位。這樣可以有效避免資源在非關(guān)鍵抗原靶標(biāo)上的浪費(fèi)，將目標(biāo)集中在具有誘導(dǎo)殺菌抗體能力的抗原上，為以高效殺菌抗體為目標(biāo)的亞單位疫苗設(shè)計開通快捷通道。

近年來，單克隆抗體生產(chǎn)方法的進(jìn)步使人們能夠直接從病人來源的質(zhì)粒或記憶 B 細(xì)胞中快速克隆出大量單克隆抗體[26-27]。新一代測序也有助于闡明抗體對感染和疫苗接種的反應(yīng)。這些進(jìn)展可能會幫助了解抗體反應(yīng)在活動性結(jié)核感染期間如何發(fā)展，再利用目前的一些新技術(shù)，可以為接下來結(jié)核抗體的研究提供有利基礎(chǔ)。高效殺菌抗體可以應(yīng)用于診斷型試劑的開發(fā)和治療性單克隆抗體藥物的開發(fā)。殺菌抗體的作用靶標(biāo)的鑒定，不僅可以闡明結(jié)核菌感染和免疫逃逸的關(guān)鍵機(jī)制，還可用于高效亞單位疫苗的開發(fā)。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.012

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2019-05-24