蘇城，盧錦標

結核分枝桿菌感染人群的免疫干預進展

蘇城，盧錦標

102629 北京，中國食品藥品檢定研究院結核病疫苗室

自結核病的病原體——結核分枝桿菌（，Mtb）被 Robert Koch 發(fā)現(xiàn)以來，結核病患者的免疫治療研究就此拉開了帷幕[1]。Koch 當仁不讓地成為開展結核病免疫治療的第一人。他發(fā)現(xiàn)，豚鼠初次皮內攻擊 Mtb 4 ~ 6 周后，再次皮內注射 Mtb 活菌或結核菌素（舊結核菌素，OT），會使豚鼠的病理性反應有所減輕，表現(xiàn)為注射部位的病灶很快壞死并脫落，而留下的潰瘍通常較易愈合[2]。動物實驗上的這種好轉跡象給了 Koch 啟發(fā)。然而，當他用結核菌素對結核患者進行免疫治療時，卻產生了意想不到的后果，部分結核病患者的病變加重，出現(xiàn)發(fā)燒和休克等癥狀，甚至注射后幾小時內死亡[3]。這種現(xiàn)象（即 Koch 現(xiàn)象）的原因在于，已感染 Mtb 個體再次接觸大量結核抗原后，淺表處病灶組織的壞死并不能起到保護作用，反而導致深層病灶大量結核活菌的暴露，使得 T 細胞介導的特異性細胞因子大量表達釋放，引起組織損傷，甚至器官衰竭[3]。

隨著第一代抗結核藥物鏈霉素和異煙肼的出現(xiàn)，第一代免疫治療方式由于高風險而很快被拋棄?？股貎?yōu)異的治療效果挽救了無數(shù)結核患者的性命，然而，其治療弊端也如影隨行，長期的肝腎毒性導致患者不耐受，依從性低，既降低了療效，又增加了耐藥結核的風險。時至今日，抗結核藥物已開發(fā)多達三十余種，這種弊端仍無法避免，且由于新化學藥物開發(fā)的周期越來越長，“新藥-耐藥-新藥”的研究模式也難以為繼，并導致了各種耐藥結核的出現(xiàn)。因此，在化學藥物治療方式作為當前結核病主要控制手段的同時，免疫治療又重新進入研究者的視野，期待能成為結核病患者治療的新方法。同時，由于結核潛伏感染（LTBI）人群約占總人口的 1/4[4]，這部分人群的免疫預防也成為結核病防控的關鍵。本文針對 Mtb 感染人群（結核病患者和 LTBI）的免疫干預措施進行綜述，為國內結核病疫苗研究者提供借鑒。

1 結核病患者的免疫治療

結核病患者的免疫干預措施一般是在化療的基礎上，增加免疫治療，以提高結核病的治愈率?？股貙ιL期結核菌的殺滅作用立竿見影。常規(guī)的化療可迅速殺死大量結核菌，但極少部分結核菌轉入休眠期后，由于代謝不活躍，化療效果大打折扣，這也是目前臨床上化療常需要長達半年以上的原因所在。而通過疫苗免疫，激發(fā)機體的免疫功能，有望提高機體清除結核菌的能力。目前，先化療后免疫模式在分枝桿菌菌體滅活疫苗上研究得較為深入，此類疫苗有母牛分枝桿菌疫苗、RUTI、MIP 等。

1.1 母牛分枝桿菌疫苗

最早冠以“母牛分枝桿菌”疫苗研究的是英國倫敦大學學院 John Stanford 教授[5]。20 世紀 90 年代，他主導研發(fā)的“母牛分枝桿菌”滅活疫苗在世界范圍內多個國家開展了一系列小到中規(guī)模的隨機、安慰劑對照、部分盲法的臨床試驗，研究對象包括初治、復治以及耐多藥結核病患者，以評價疫苗的免疫治療效果[5]。這些研究從最初單劑量的不甚理想，到后期轉變?yōu)槎鄤┝亢箫@示出良好的輔助治療效果。因此，WHO 在 20 世紀 90 年代初的結核病研究與發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃中，以母牛分枝桿菌（）為例，提出了化療和免疫治療相結合的思路[6]。需指出，隨著分子生物分型工具的發(fā)展，John Stanford 教授發(fā)現(xiàn)的“母牛分枝桿菌”（NCTC 11659）被證實為另一種分枝桿菌，之前的分析認為和奧布分枝桿菌（）同源性更高[7]，現(xiàn)新的鑒定結果表明，該菌株應歸于一類新的分枝桿菌，并被命名為.[8]。

受 WHO 政策影響，國內 20 世紀 90 年代初開始了母牛分枝桿菌疫苗的研究[9]。1996 – 1998 年，母牛分枝桿菌疫苗先后完成了初、復治和難治菌陽活動性肺結核共 568 例的臨床療效對照觀察[10]。從公布的初治肺結核療效報告看，該臨床研究中，共納入 342 例初治菌陽肺結核患者，隨機分為疫苗組和對照組（各 171 例）。疫苗組采用抗結核藥物（2HRZE/2HR）聯(lián)合疫苗治療 6 個月；對照組僅采用抗結核藥物治療（2HRZE/4HR）。結果顯示，母牛分枝桿菌疫苗不良反應少且較輕微，免疫治療后可加快結核菌陰轉、病灶吸收及空洞縮小關閉速度；1 年后隨訪，疫苗組的細菌學復發(fā)率（3.0%）顯著低于對照組（5.6%），復發(fā)率低。2001 年，國內自主研發(fā)的注射用母牛分枝桿菌疫苗（商品名：微卡）獲得生產文號，由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司生產，正式應用于臨床結核病化療的輔助治療。目前的 Meta 分析表明，微卡聯(lián)合抗生素治療安全性好，有利于初治、復治和耐藥結核病患者的痰菌轉陰，增強化療效果，提高臨床治愈率，但其遠期療效有待進一步研究[11-12]。

1.2 RUTI

RUTI 疫苗是 Mtb H37Rv 在低氧分壓、低 pH 以及低營養(yǎng)條件下培養(yǎng)，收獲后經破碎和 Triton X-114脫毒，包埋于脂質體中制備而成[13]。在生長壓力條件下，Mtb 表達更多的潛伏性抗原，因此 RUTI 疫苗可誘導針對生長期和非生長期 Mtb 多種抗原的特異性免疫應答。在不同動物模型上，RUTI 疫苗誘導的細胞應答呈現(xiàn)出 Th1/Th2/Th3 混合型，同時也可激發(fā)多達 13 種結核抗原的 IgG1、IgG2a 和 IgG3 抗體表達，與抗生素化療聯(lián)合使用，展現(xiàn)出良好的免疫效果[13]。RUTI 疫苗的臨床試驗研究主要包括化療后的輔助治療。已完成的臨床研究顯示高劑量 RUTI 的不良反應偏高，且多針次免疫并不能促進疫苗的免疫應答效果[14-15]。目前 RUTI 疫苗正在開展用于 MDR-TB 輔助治療的臨床 IIa 試驗（NCT02711735），耐多藥結核病患者采用標準化療方案治療 12 周或 16 周后，免疫 1 針次 RUTI 疫苗，評價其安全性和免疫原性，并以痰菌載量為指標評價疫苗的免疫效果。該研究預計 2020 年完成。

1.3 MIP

MIP 疫苗為非結核分枝桿菌的滅活產物，早期在印度用于麻風病患者的輔助治療[16]。2000 年初，一項非隨機的臨床試驗提示 MIP 疫苗聯(lián)合化療可提高結核病患者的治愈率[17]。之后印度完成了 MIP 疫苗免疫治療結核性心包炎的臨床 III 期試驗，結果顯示 MIP 疫苗沒有明顯療效[18]。另一項 MIP 疫苗用于復治結核病免疫治療的隨機、雙盲、安慰劑對照的多中心臨床 III 期試驗中，受試者在化療強化期開始注射 MIP 疫苗，共 6 針次[19]。結果顯示，與單純化療（安慰劑組）比較，MIP 疫苗沒有不良反應，且 MIP 疫苗組的痰培養(yǎng)陰轉率均顯著高于安慰劑組，表明 MIP 疫苗可能有清除結核桿菌的作用。

2 結核潛伏感染人群的免疫預防

按新的數(shù)學建模結果估計[4]，全球約 1/4 人口，即17 億，為 LTBI。一般情況下，絕大多數(shù) LTBI 可終身保持健康，但其中 5% ~ 10% 作為易感人群，最終會發(fā)展成活動性結核病，成為新的感染源。另外，對于如 HIV 感染，接受免疫抑制劑治療等因素造成的免疫功能低下者，LTBI 轉變成活動性 TB 的概率也會大幅度提高。中國作為目前全球結核病負擔第二高的國家[20]，對 LTBI 人群提前干預，降低其發(fā)病率是控制中國結核病的關鍵。相對抗生素治療，疫苗的免疫預防是最具成本效益的衛(wèi)生干預措施，也是應對耐藥結核病傳播的最佳手段。現(xiàn)唯一可用的結核疫苗是卡介苗（BCG），預防兒童腦膜炎和播散性結核病的效果顯著，但對成人保護效果不充分，也對 LTBI 無效[21]。因此，針對 LTBI 的預防用疫苗一直是國內外結核新疫苗研究的熱點。目前已有多個結核新疫苗在臨床試驗中用于 LTBI 人群的安全性和免疫原性評價。

2.1 重組 AEC/BC02 疫苗

重組結核疫苗 AEC/BC02 由重組 Mtb 蛋白 Ag85b、ESAT6-CFP10 與復合佐劑系統(tǒng) BC02 構成，是目前國內首個進入臨床研究的結核新疫苗。在臨床前的動物保護力研究中，通過建立豚鼠潛伏感染模型，評價疫苗的免疫干預效果。多次評價結果顯示，與未采用免疫干預的對照組比較，AEC/BC02 疫苗免疫可有效減輕 Mtb 感染豚鼠的肝脾肺臟器病變程度，并降低脾肺臟的活菌載量[22-24]。2018 年4 月，AEC/BC02 疫苗正式開啟潛伏感染人群免疫預防的臨床 I 期試驗（NCT03026972），擬招募 135 例受試者，包括具有 PPD、IGRA 和 EC 不同免疫標識的四類人群，以評價該疫苗的安全性和免疫原性。該研究預計 2019 年完成。

2.2 母牛分枝桿菌疫苗

母牛分枝桿菌疫苗（微卡）除了作為結核病患者的免疫治療，也用于 LTBI 的免疫預防。2012 年 12月，經國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準，微卡作為預防用生物制品獲得臨床批件，并于 2013 年 10 月正式開展 III 期臨床試驗（NCT01979900）。該研究為嚴格意義的雙盲、隨機、安慰劑對照試驗，共納入 15 ~ 65 歲 LTBI 受試者 10000 名，用于評估微卡免疫預防的有效性和安全性[20]。目前全部研究已于 2018 年完成，但尚未發(fā)布詳細的臨床結果。

2.3 重組 M72/AS01 疫苗

葛蘭素史克（GSK）公司篩選出兩種免疫原性強的結核抗原 Mtb39 和 Mtb32[25]，重組表達出融合蛋白 M72（Mtb32C-Mtb39-Mtb32N），與 AS01 佐劑系統(tǒng)構成 M72/AS01 結核疫苗。AS01 佐劑是由單磷酰脂 A（MPLA）和皂素 QS-21 構成的脂質體，能形成抗原庫，使抗原緩慢釋放，并對 Th1 細胞的刺激作用明顯強于 Th2 細胞，其中，MPLA 通過 TLR4 激活 Th1 和 Th17 T 細胞，QS-21 則有助于激活 CD8+CTL 細胞，兩者聯(lián)合使用可發(fā)揮協(xié)同效應，使抗原刺激的特異性免疫反應達到最大效力[26]。臨床前研究中，M72/AS01 疫苗在不同動物模型上均表現(xiàn)出良好的保護效果，可降低肺和脾的細菌載量，延緩或防止體重下降和死亡，以及緩解肺部損傷[27-28]。

迄今，GSK 公司已在多個國家完成了 M72/AS01 疫苗的一系列臨床試驗，顯示出 M72/AS01 疫苗在不同目標人群良好的安全性和免疫原性[29-32]。最近發(fā)布的 M72/AS01E疫苗在肯尼亞、南非和贊比亞進行的隨機、雙盲、安慰劑對照的臨床 IIb 試驗結果令人關注[32]。該研究旨在評價疫苗對 LTBI 成人的安全性和免疫預防效果，入組 3573 例 18 ~ 50 歲 HIV 陰性的 LTBI 成人，其中 1786 例接種 M72/AS01E疫苗，1787 例接種安慰劑，共肌內 2 劑，間隔 1 個月。2.5 年隨訪時間內，疫苗組 1623 例納入觀察，發(fā)病 10 例，安慰劑組 1660 例納入觀察，發(fā)病 22 例。最終獲得的疫苗保護率為 54%（95%CI，2.9% ~ 78.2%），且無明顯的安全問題。該結果是目前結核新疫苗研究多年來的一個重大突破，首次證實免疫干預可降低 Mtb 感染人群發(fā)展成活動性結核的風險。同時，考慮 75% 受試者有 BCG 接種史，意即在 BCG 接種后，通過接種其他疫苗，可獲得更高的保護效果。不過，盡管該疫苗 54% 的免疫預防效果滿足 WHO 對成人用結核新疫苗保護力的要求[33]，但其持久的保護效果如何還需進一步延長隨訪時間。

3 小結和展望

在疫苗安全性受到大眾廣泛關注的今天，Mtb 感染人群的免疫干預需要特別注意其安全性，尤其是發(fā)生“Koch 現(xiàn)象”的風險。如早期 Koch 用舊結核菌素治療結核病患者一樣，動物模型上也可觀察到類似現(xiàn)象。已感染 Mtb 的小鼠注射結核抗原后，相比未注射組，大量炎癥因子表達，造成免疫損傷[34-35]。這可能是由于處于活動性結核病進程的機體的免疫應答異常活躍，再接觸到結核抗原，類似于舊結核菌素，引發(fā)了超敏反應。對結核疫苗，尤其是分枝桿菌菌體類疫苗，其抗原成分復雜，導致“Koch 現(xiàn)象”的風險也可能較高。從上述結核疫苗的臨床研究看，研究者常采用化療和免疫相結合的綜合干預措施。通過化療殺滅大部分生長期結核菌，機體亢奮的免疫應答得到抑制，再免疫疫苗，激發(fā)的是溫和的免疫應答反應，從而降低免疫損傷的風險。在疫苗安全性得到保證的前提下，疫苗的免疫干預效果是臨床研究的另一個評價重點。由于對結核病感染和免疫相關機制的理解并不透徹，目前尚未發(fā)現(xiàn)與疫苗保護作用相關的生物學指標，免疫干預效果的評估仍依賴于流行病學調查。如果能發(fā)現(xiàn)合適的免疫標志物反映臨床評價終點，以縮短試驗周期并降低成本，將有利于更多的結核候選疫苗進入臨床評價階段，從而增加臨床試驗的成功幾率。期望隨著技術的發(fā)展，最終實現(xiàn)對 Mtb 感染人群可實施有效的免疫干預措施，無疑將提高現(xiàn)有的結核病防控效果。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.011

國家自然科學基金面上項目（81572068）

盧錦標，Email：lujinbiao@nifdc.org.cn

2019-05-14