吳曉清 尤小蘭 汪正 唐小麗 張琪 金芝祥 王道榮（通訊作者）

（1揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(揚(yáng)州大學(xué)附屬蘇北醫(yī)院)胃腸外科 江蘇 揚(yáng)州 225001）

（2揚(yáng)州大學(xué)-揚(yáng)州市普通外科研究所 江蘇 揚(yáng)州 225001）

胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，盡管胃癌的診斷和治療已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是進(jìn)展期胃癌患者的五年生存率仍不足40%[1]。本實(shí)驗(yàn)就Gal-1和CXCR4在胃癌中的表達(dá)進(jìn)行探索研究，并分析其表達(dá)與胃癌患者術(shù)后OS之間的關(guān)系，旨在為胃癌的靶向治療提供可供參考的新靶點(diǎn)。

1.材料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年1月—6月在江蘇省蘇北人民醫(yī)院胃腸外科行胃癌根治術(shù)的的胃癌患者的標(biāo)本及臨床資料，共75例患者納入本研究，所有病例術(shù)前未行放、化療及其他抗腫瘤治療，臨床隨訪資料完整。本組病例中男性52例，女性23例，年齡60.07±8.91（37～77）歲。

兔抗人galectin-1、CXCR4抗體、兔抗鼠二抗（美國(guó)Santa Cruz公司）；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PBS液、檸檬酸修復(fù)液、枸櫞酸鹽緩沖液、0.1%HCl、4%甲醛溶液、酒精、二甲苯、丙酮酸、樹(shù)膠等由江蘇省蘇北人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)胃癌組織的Gal-1和CXCR4的表達(dá)

所有標(biāo)本均經(jīng)蘇木-伊紅（HE）染色證實(shí)為胃腺癌，胃癌組織蠟塊4μm切片，置于二甲苯、梯度酒精水化，過(guò)氧化氫浸泡去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，檸檬酸修復(fù)抗原，血清封閉液封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2h，DAB顯色5min，蘇木素復(fù)染，依次梯度酒精、二甲苯脫水，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察。

1.3 染色結(jié)果的判定

在雙盲情況下，由兩位主治醫(yī)生職稱(chēng)以上病理醫(yī)生獨(dú)立評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞在全部胃癌細(xì)胞所占的比例計(jì)分： 0分（0%～5%）， 1分（6%～25%）， 2分（26%～50%）， 3分（51%～75%）， 4分（＞75%）；按照著色強(qiáng)度計(jì)分：0分（陰性），1分（弱陽(yáng)性），2分（中等陽(yáng)性），3分（強(qiáng)陽(yáng)性），最終評(píng)分為兩者乘積（0～12分）。

1.4 隨訪

術(shù)后3月開(kāi)始隨訪登記，采用電話、信件、門(mén)診復(fù)查、建立微信群等方式進(jìn)行隨訪。定期進(jìn)行胸腹部CT、胃鏡或全身PET-CT、血尿糞三大常規(guī)、血生化、腫瘤標(biāo)記物等檢查了解腫瘤有無(wú)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。隨訪截止時(shí)間為2018年10月31日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，Log-rank法比較兩組的生存率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 Gal-1、CXCR4蛋白在胃癌組織中表達(dá)情況

應(yīng)用IHC檢測(cè)了75例蠟塊包埋的原發(fā)性胃癌組織中Gal-1及CXCR4蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果示Gal-1蛋白的免疫組化積分是7.05±2.65（1～12），CXCR4蛋白的IHC積分是6.41±2.24（2～12）。對(duì)免疫組化積分結(jié)果進(jìn)行ROC檢驗(yàn)，結(jié)果示Gal-1蛋白及CXSR4蛋白的cut-off值均為5。按照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，75例患者中有59例（78.7%）Gal-1陽(yáng)性表達(dá)，16例（21.3%）患者Gal-1陰性表達(dá)； 21例（28%）患者CXCR4蛋白陽(yáng)性表達(dá)，54例（72%）陰性表達(dá)。

2.2 胃癌組織中Gal-1蛋白與CXCR4蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示原發(fā)性胃癌組織中Gal-1蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.912，P＜0.05）。所有CXCR4蛋白陽(yáng)性表達(dá)組織中Gal-1蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性。

2.3 胃癌組織中Gal-1、CXCR4蛋白的表達(dá)與患者的預(yù)后分析

所有患者均得到有效隨訪，中位隨訪時(shí)間為術(shù)后41（5～70）個(gè)月。其中47例患者發(fā)生胃癌相關(guān)性死亡，5年生存率37.33（28/75）。根據(jù)Gal-1表達(dá)情況，將患者分為Gal-1陽(yáng)性組（n=59）和Gal-1陰性組（n=16）。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，Gal-1陽(yáng)性組患者的總生存期（OS）為42.63±2.758個(gè)月；Gal-1陰性組患者的OS為57.94±4.11個(gè)月；兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.24，P＜0.05）。同樣，根據(jù)CXCR4蛋白檢測(cè)結(jié)果將患者分為CXCR4陽(yáng)性組（n=54）和CXCR4陰性組（n=21）。CXCR4陽(yáng)性組患者的OS為41.17±2.86個(gè)月；CXCR4陰性組患者的OS為57.68±3.57個(gè)月；兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.57，P＜0.05）。

此外，聯(lián)合分析 Gal-1、CXCR4對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響，將胃癌患者分為三組，其中Gal-1、CXCR4均為陰性組患者（n=16）的OS時(shí)間為57.94±4.11個(gè)月；Gal-1陽(yáng)性、CXCR4陰性組患者（n=5）的OS為：55.60±6.94個(gè)月；Gal-1、CXCR4均為陽(yáng)性組患者（n=54）的OS為：41.17±2.86；三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.57，P＜0.05）。

3.討論

Gal-1是由LGALS1基因編碼的含有135個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在多種腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)[2]，參與多種腫瘤進(jìn)程[3-4]。然而關(guān)于Gal-1與胃癌的預(yù)后目前罕見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，我們通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢查了75例胃腺癌組織樣本中的Gal-1和CXCR4蛋白表達(dá)情況。78.67%的患者Gal-1蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，Kaplan-Meier生存分析證實(shí)Gal-1在胃癌中具有顯著的預(yù)后價(jià)值。Gal-1陽(yáng)性患者的生存率顯著低于Gal-1陰性的患者。因此，檢測(cè)胃癌組織中Gal-1的表達(dá)可能有助于判斷胃癌患者的預(yù)后。

CXCR4與趨化因子12（CXCL12）結(jié)合參與體內(nèi)多種生理機(jī)制，對(duì)于多種腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移起重要作用。我們發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白的表達(dá)隨著Gal-1的過(guò)表達(dá)而增加，并且與胃癌患者不良的生存率顯著相關(guān)。

已有研究發(fā)現(xiàn)在腎癌細(xì)胞中Gal-1可以介導(dǎo)CXCR4的表達(dá)影響腎癌患者的預(yù)后，但是在胃癌細(xì)胞中Gal-1與CXCR4蛋白表達(dá)的相關(guān)性目前未見(jiàn)報(bào)道。CXCR4蛋白影響胃癌患者預(yù)后的機(jī)制尚不完全清楚，我們的實(shí)驗(yàn)顯示CXCR4蛋白與胃癌組織中Gal-1的表達(dá)顯著相關(guān)。Gal-1和CXCR4蛋白與患者的預(yù)后具有一致性，這提示其中存在相應(yīng)的聯(lián)系。我們的結(jié)果顯示Gal-1和CXCR4蛋白的過(guò)表達(dá)尤其是兩者同時(shí)存在與胃癌患者的不良生存率顯著相關(guān)。因此我們預(yù)測(cè)Gal-1和CXCR4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)提示胃癌的不良預(yù)后，Gal-1和CXCR4蛋白有望成為胃癌新的預(yù)后標(biāo)志物。