黃琦 王芳 田進(jìn)海 于晶晶 王嘉 王立斌（通訊作者）

（1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 寧夏 銀川 750004）

（2寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站 寧夏 銀川 750001）

miRNA是機(jī)體內(nèi)的一種短鏈RNA，該物質(zhì)在經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后可以對(duì)相關(guān)細(xì)胞的周期、凋亡、侵襲、血管生成以及遷移等過(guò)程進(jìn)行水平調(diào)節(jié)，從而對(duì)其細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過(guò)程產(chǎn)生影響。本文分析miRNA-210對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取來(lái)院就診與治療的患有乳腺癌疾病的患者20例，研究對(duì)象選取時(shí)間為2016年8月－2018年8月。本次研究通過(guò)道德倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且經(jīng)過(guò)患者的同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 Real-timePCR法 首先提取總RNA（乳腺癌組織），并且將提取后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)為cDNA［1］。miR-210細(xì)胞的上游引物序列為CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA，通用引物 Uni-miR realtime PCR引物為miR-210細(xì)胞的下游引物。隨后模版選取cDNA，內(nèi)參選取U6B，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后需要設(shè)置3個(gè)復(fù)孔［2］。

1.2.2 miR-210inhibitor轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231細(xì)胞中 將miR-210 inhibitor、miRNA inhibitor NC粉末（具有FAM 熒光標(biāo)記）進(jìn)行離心處理，在離心處理完畢后將其配置成溶液，濃度為20μmol/L。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前的1d鋪設(shè)24孔板，以此來(lái)提高溶液的融合度，一般融合度需要提高至30～50%。上述操作完畢后，將無(wú)抗生素（500μL）的培養(yǎng)基加入培養(yǎng)板中，隨后可以混合miRNA和 Lipofectamine 2000，20min室溫孵育。在MB-231細(xì)胞中加入混合物進(jìn)行搖勻，在37℃下進(jìn)行孵育［3］。

1.2.3 Transwell法 遷移：在轉(zhuǎn)染后的48h進(jìn)行試驗(yàn)，加入1300μL完全培養(yǎng)基加入24孔板中，隨后將其放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行過(guò)夜放置，對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)加入200μl含0.2%BSA 的無(wú)血清細(xì)胞懸液，將1300μL完全培養(yǎng)基加入下層孔板中，隨后將其置于37℃中進(jìn)行培養(yǎng)，隨后進(jìn)行封片處理，并且進(jìn)行計(jì)數(shù)。

侵襲：在轉(zhuǎn)染后的48h進(jìn)行試驗(yàn)，按照1：8稀釋基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基1d后鋪于小室上，隨后對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)加入200μl含0.2% BSA 的無(wú)血清細(xì)胞懸液至每孔中，將1300μL完全培養(yǎng)基加入下層孔板中，隨后進(jìn)行封片處理，并且進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采取統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 miR-210表達(dá)水平

miR-210在乳腺癌組織中的表達(dá)水平為（9.53±4.82），癌旁組織為（1.0±0.18），MDA-MB-231細(xì)胞為（6.04±1.74），正常乳腺細(xì)胞為（1.0±0.15），故乳腺癌組織、MDA-MB-231細(xì)胞與癌旁組織、正常乳腺細(xì)胞等組織中的miR-210表達(dá)水平差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 miR-210inhibitor轉(zhuǎn)染效率

miR-210inhibitor轉(zhuǎn)染效率為（88.28±2.99）%，結(jié)果說(shuō)明miR-210 inhibitor已成功轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231 細(xì)胞。故經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染后，其細(xì)胞的增值能力較轉(zhuǎn)染前顯著下降。

2.3 抑制細(xì)胞增殖情況

轉(zhuǎn)染miR-210inhibitor細(xì)胞的克隆集落數(shù)為（17.39±2.98）個(gè)，而轉(zhuǎn)染miR-INC 組細(xì)胞的克隆集落數(shù)為（31.76±3.93）個(gè)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。遷移試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-210inhibitor細(xì)胞的遷出細(xì)胞數(shù)量為（291.00±43.13）個(gè)，而轉(zhuǎn)染miR-INC 組細(xì)胞的遷出細(xì)胞數(shù)量為（1137.39±89.48）個(gè)，侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-210inhibitor細(xì)胞降解基質(zhì)膠且遷出細(xì)胞數(shù)量為（131.63±32.02）個(gè)，而轉(zhuǎn)染miR-INC 組細(xì)胞降解基質(zhì)膠且遷出細(xì)胞數(shù)量為（647.89±31.22）個(gè)，故經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染后，其細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到明顯抑制。

3.討論

根據(jù)大量數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌疾病已經(jīng)成為危害婦女身心健康的主要惡性腫瘤之一，且該類疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。隨著我國(guó)醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)于該類疾病的治療出現(xiàn)了一種新形式，即分子靶治療。而分子靶治療需要一個(gè)有效的靶點(diǎn)，而miRNA便成為了診斷與治療的有效靶點(diǎn)。根據(jù)大量研究數(shù)據(jù)顯示，位于腫瘤相關(guān)基因組的區(qū)域和雜合型丟失區(qū)、脆性位點(diǎn)、擴(kuò)增區(qū)或斷裂點(diǎn)區(qū)的miRNA超過(guò)一半，這些miRNA均可以作為抑癌基因或者致癌基因進(jìn)而發(fā)揮作用，引發(fā)患者癌細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲等進(jìn)程。目前，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)是miRNA的已知功能，可以作為負(fù)調(diào)控因子來(lái)參與基因的表達(dá)過(guò)程。同時(shí)有部分研究數(shù)據(jù)顯示，miRNA的作用靶點(diǎn)可以作為抑癌基因處于患者機(jī)體內(nèi)的擴(kuò)增區(qū)來(lái)下調(diào)miRNA的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑癌基因樣作用。同時(shí)其靶點(diǎn)還可以作為癌基因，當(dāng)此基因表達(dá)水平顯著升高時(shí)，可以對(duì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生抑制的作用。而在人乳腺癌細(xì)胞中，很多miRNA會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)的情況，在細(xì)胞的不同階段表達(dá)出不同的作用。miR-21會(huì)在乳腺癌患者機(jī)體內(nèi)的癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其可能的靶基因?yàn)橐职┗騎PM1、PDCD4等。而miR-10b可以會(huì)對(duì)機(jī)體內(nèi)的HOXSD10產(chǎn)生抑制的作用從而達(dá)到促進(jìn)轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞的作用，除此之外，在乳腺癌中miR-206還會(huì)與其表達(dá)水平以及ER的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系。同時(shí)有部分研究顯示，組織的miRNA表達(dá)譜與乳腺癌患者的外周血循環(huán)miRNA表達(dá)譜有著較為密切的關(guān)聯(lián)，同時(shí)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后，腫瘤臨床分期有著密切的關(guān)系。故在臨床診斷乳腺癌疾病中可以添加miR-210等指標(biāo)來(lái)進(jìn)行診斷，提升疾病的診斷率。

miRNA在臨床上不僅具有較高的診斷價(jià)值，還可以作為一種新型的靶向治療手段，機(jī)體內(nèi)的miRNA可以對(duì)乳腺癌患者的原癌基因以及抑癌基因的表達(dá)進(jìn)行有效調(diào)控，而根據(jù)大量文獻(xiàn)顯示，采取miRNA來(lái)作為治療靶點(diǎn)可以起到更佳有效的效果，特別是針對(duì)于單一的癌基因或者抑癌基因，目前在臨床試驗(yàn)階段已經(jīng)加入了與miRNA功能相類似的小干擾RNA的相關(guān)藥物，現(xiàn)階段，已經(jīng)有部分報(bào)道顯示，在機(jī)體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miRNA的阻斷劑可以將腫瘤轉(zhuǎn)移的靶基因表達(dá)有效促進(jìn)，并且可以對(duì)轉(zhuǎn)移灶的形成有效防止。

綜上所述，miRNA-210對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響較大，可以明顯減弱其能力，本文研究結(jié)果也證實(shí)了miRNA-210的作用。