近年來，CRISPR-Cas9技術(shù)介導(dǎo)的突變篩選在小鼠和人細(xì)胞中已被廣泛應(yīng)用，而實(shí)現(xiàn)高效的小鼠個體水平遺傳篩選對哺乳動物功能基因組研究具有重要意義。

中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）李勁松和鄒衛(wèi)國研究團(tuán)隊合作應(yīng)用孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞（“人造精子細(xì)胞”）介導(dǎo)的半克隆技術(shù)，結(jié)合CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了小鼠骨發(fā)育相關(guān)基因的個體水平遺傳篩選，并揭示Irx5基因作為骨發(fā)育過程中重要調(diào)控因子，通過抑制PPARγ分子促進(jìn)成骨分化并抑制成脂分化，為小鼠發(fā)育過程中關(guān)鍵基因功能研究開辟了新的途徑。該研究成果在線發(fā)表于《美國科學(xué)公共圖書館·生物》（Plos Biology）。

李勁松研究員介紹，科研人員基于體外成骨分化過程高通量測序分析數(shù)據(jù)，篩選了72個潛在骨發(fā)育相關(guān)基因，建立了一個攜帶216個向?qū)NA（sgRNA）的單倍體干細(xì)胞庫（即“人造精子細(xì)胞庫”），其中的每個“人造精子”一般都攜帶一個針對不同基因的“sgRNA導(dǎo)航器”，精確定位到靶基因上并對其進(jìn)行基因編輯。李勁松解釋道，“我們將這些攜帶修飾基因的‘人造精子’逐一注射入小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞，一個月不到，就獲得了400多只攜帶不同突變基因的半克隆小鼠?！?/p>

鄒衛(wèi)國研究員說：“我們在這些小鼠出生后，就開始對其進(jìn)行骨骼整體染色分析，依據(jù)骨骼大小、鈣化、顱頂骨、長骨、椎骨形態(tài)等指標(biāo)對每只小鼠進(jìn)行評分。與此同時，我們利用每只小鼠攜帶的‘sgRNA導(dǎo)航器’對骨發(fā)育異常的小鼠所攜帶的‘靶基因’的測序分析，最終確定其是否存在基因突變。”

“我們從72個候選基因中篩選出了4個參與骨發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵基因。”鄒衛(wèi)國進(jìn)一步介紹說，“在這4個關(guān)鍵基因中，基因Zic1和Clec11a被其他研究證實(shí)參與骨發(fā)育調(diào)控，而基因Rln1和Irx5在小鼠骨發(fā)育過程中的功能尚不明確。為了驗(yàn)證它們在小鼠骨骼發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制，我們構(gòu)建了基因Rln1和基因Irx5敲除的小鼠模型來驗(yàn)證這兩個基因在骨發(fā)育過程中的作用，發(fā)現(xiàn)敲除了Rln1基因的小鼠在出生時骨骼較小，而成年后差異不顯著；敲除基因Irx5的小鼠在出生時和成年后骨骼較小和骨量下降特征均很顯著，同時伴隨著骨髓中脂肪形成增加的特征。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明，IRX5通過抑制PPARγ通路的激活，促進(jìn)成骨分化同時抑制脂肪生成。”

“這項研究的理論價值在于首次實(shí)現(xiàn)了小鼠個體水平骨發(fā)育靶向遺傳篩選?！闭劶皩τ谖磥淼呐R床應(yīng)用價值，鄒衛(wèi)國表示，“我們希望我們的基礎(chǔ)研究能為臨床服務(wù)，為骨質(zhì)疏松癥的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用等提供理論支撐?！?/p>