王艷梅，馮 佳，呂俊平，劉 琪，南芳茹，謝樹蓮

(山西大學 生命科學學院，太原 030006)

裸藻類是真核生物演化過程中的一個獨立支系，起源較早，絕大多數種類是單細胞，只有極少數是由多個細胞聚集成的不定群體[1-2]。裸藻類植物兼有動植物雙重性狀，多數種類可以吞噬或胞飲方式吸收營養(yǎng)，具有色素體的種類可進行光合作用?，F已有研究表明，綠色裸藻類是通過二次內共生起源的[3-6]。

綠色裸藻的最早發(fā)現可以追溯到340多年前，然而，作為一個生物類群進行系統(tǒng)的分類研究卻經過了150多年[7]。從19世紀30年代開始，有關綠色裸藻的研究逐漸發(fā)展起來，先后報道了裸藻屬(Euglena)[8]、隱裸藻屬(Cryptoglena)[9]、柄裸藻屬(Colacium)[10]、囊裸藻屬(Trachelomonas)[10]、扁裸藻屬(Phacus)[11]、鱗孔藻屬(Lepocinclis)[12]、雙鞭藻屬(Eutreptia)[13]、旋形藻屬(Monomorphina)[14]、擬雙鞭藻屬(Eutreptiella)[15]和陀螺藻屬(Strombomonas)[16]，特別是隨著分子生物學手段的引入，有關綠色裸藻類分類和系統(tǒng)發(fā)育的研究有了進一步深入的發(fā)展，相繼建立了盤裸藻屬(Discoplastis)[17]、眼裸藻屬(Euglenaria)[18]和吞噬藻屬(Rapaza)[19]。迄今，綠色裸藻類共報道上述13屬。

綠色裸藻類有很多共同特征，細胞大多或多或少呈紡錘形，少數為圓柱形、橢圓形或卵形，有的細胞側扁，無細胞壁，但質膜內有特化的表質，也叫周質體，有的種類胞外具囊殼，細胞前端具有胞口、胞咽、伸縮泡、眼點等結構，具1～2條鞭毛，細胞核較特殊，有絲分裂時，核膜和核仁不消失，色素體形狀多樣，大小和數目不一，貯藏物質為副淀粉[20]。

長期以來，裸藻類的形態(tài)結構是其重要的分類依據[21]。施之新[22]曾基于形態(tài)性狀對裸藻類的系統(tǒng)發(fā)育進行過研究。然而，單純以形態(tài)特征來探究裸藻類植物的系統(tǒng)發(fā)育是不完善的，有的種類形態(tài)很相似，但遺傳距離卻很遠[18]。以形態(tài)特征和分子數據相結合研究綠色裸藻類的系統(tǒng)發(fā)育及性狀進化很有必要。

葉綠體16S rRNA基因是所有原核和真核生物共同具有的基因，目前GenBank已收錄了數萬條16S rRNA基因序列，積累了豐富的序列資料。同時16S rRNA 參與細胞的肽鏈合成，在進化上高度保守，因此是構建進化譜系的理想基因[23]。植物葉綠體中rRNA基因排列順序與原核生物大腸桿菌和藍綠藻的rRNA基因排列順序相似，而且這些rRNA基因大多處于反向重復區(qū)內，即有2套方向相反的rRNA基因[24]。由于16S rDNA序列一級結構比較保守，而二級結構又表現出螺旋差異性，較適用于種、屬水平的系統(tǒng)學研究[25-26]。

本研究基于葉綠體16S rRNA基因序列，構建了綠色裸藻類的系統(tǒng)發(fā)育關系，并對其性狀進行了分析和祖先重建，以期探討綠色裸藻類的系統(tǒng)演化關系，為研究該類植物的起源提供進一步的證據。

1 材料和方法

1.1 分類單位

本研究包含了綠色裸藻類植物12屬88種(表1)。

1.2 方 法

1.2.1基因序列在NCBI基因庫中搜索綠色裸藻類各屬種所包含的全部16S rRNA基因序列，選取各個種對應的一條較長序列用于分析。各序列登錄號及對應文獻見表1。

1.2.2系統(tǒng)發(fā)育分析用BioEdit 7.0.5.3軟件進行拼接及校對，以確保準確性，之后運用MrBayes3.2軟件構建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3性狀的選擇性狀選擇以選取盡可能多的相對穩(wěn)定的性狀狀態(tài)和有明顯間斷性變異的數量性狀為原則[27]。性狀狀態(tài)主要根據文獻的廣泛比較和研究來確定。用于分支分類的性狀及狀態(tài)編碼見表2。所有的性狀均為無序、等權。代表性狀狀態(tài)的數字沒有進化意義。不詳或未知的狀態(tài)用“?”表示(表1)。

網格無關性驗證條件為: 噴流Majet=1.0， Tjet=300 K， Pjet=0.96 MPa, 來流Ma∞=2.52， T∞=754 K， P∞=86 kPa. 圖2給出了使用3種網格得到的計算模型上壁面壓力系數分布. 觀察可得: 3種網格所得到的上壁面壓力系數變化趨勢一致, 其中中等網格和加密網格在數值上基本一致, 即對于本文算例, 中等密度的計算網格即可滿足計算要求.

對綠色裸藻類的形態(tài)特征進行全面的比較分析后[21，28-35]，選取8個性狀用于祖先重建。

1.2.4祖先重建分析基于系統(tǒng)發(fā)育關系研究中的MP分析，計算10 000 000代得出的10 001棵嚴格一致樹中選取最后的1 000棵樹，加入所選取的8個性狀(表2)，通過Mesquite3.40[36]軟件進行形態(tài)性狀祖先重建。

表1 綠色裸藻類序列登錄號及形態(tài)數據矩陣

續(xù)表1 Continued Table 1

表2 綠色裸藻類形態(tài)性狀編碼表

2 結果與分析

2.1 綠色裸藻類系統(tǒng)發(fā)育關系分析

貝葉斯法構建的綠色裸藻類系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)顯示，雙鞭藻屬與擬雙鞭藻屬互為姐妹群且得到高度支持(100%)。扁裸藻屬、鱗孔藻屬和盤裸藻屬位于一支，也得到了很高的支持率(100%)。囊裸藻屬和陀螺藻屬也聚為一支，同樣也得到了很高的支持率(100%)。裸藻屬、隱裸藻屬、柄裸藻屬和旋形藻屬親緣關系較近。裸藻屬不是一個單系類群，在系統(tǒng)發(fā)育發(fā)面仍需要深入研究。其它個別屬雖然也有出現嵌套現象，但整體系統(tǒng)發(fā)育關系較清晰。

2.2 綠色裸藻類祖先重建及各形態(tài)性狀原始性分析

基于形態(tài)性狀對綠色裸藻類祖先重建的結果(圖2～3)顯示：(1)表質硬化程度 表質硬化程度在綠色裸藻類不同屬表現各異，或是柔軟易變形，或是硬化而形狀固定。從該性狀的祖先狀態(tài)重建結果(圖2)可以看出，表質柔軟易變形這一性狀較原始。

(2)表質條紋 表質條紋作為綠色裸藻類的常見性狀，形態(tài)多樣，如裸藻屬、眼裸藻屬、大部分鱗孔藻屬和一部分扁裸藻屬種類為螺旋形線紋，盤裸藻屬和一部分扁裸藻屬種類表現為縱線紋，陀螺藻屬、旋形藻屬和大多數囊裸藻屬種類表現為孔紋、點紋、凸紋或肋紋，柄裸藻屬、隱裸藻屬、雙鞭藻屬和擬雙鞭藻屬等少數種類則表面光滑。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結果(圖2)可以看出，螺旋形線紋是最早出現的原始性狀。

(3)后端形狀 細胞后端或多或少漸狹是裸藻類典型特征之一，但變化較多。從該性狀的祖先狀態(tài)重建結果(圖3)可以看出，細胞后端漸尖或尖尾刺狀是最為原始的性狀。

(5)鞭毛長度 在綠色裸藻類中，鞭毛長度這一性狀特征明顯，便于觀察和測量，在同一種類中，比較穩(wěn)定，短于體長，等于體長，或長于體長，可作為典型的分辨性狀。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結果(圖4)可以看出，在發(fā)展過程中，3種性狀出現頻率相近，在可能的祖先狀態(tài)中各占一定比例，其中鞭毛等于體長這一性狀占比較小，鞭毛長于或短于體長2種性狀占比相近，原始性不確定。

(6)葉綠體形狀 葉綠體形狀是綠色裸藻類分類的重要性狀，有的為星狀，有的較大，為片狀、盾狀或大盤狀，有的較小，為小盤狀或球形。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結果(圖4)可以看出，葉綠體為片狀、盾狀或大盤狀這一性狀較原始。

分支節(jié)點處數字代表16S rRNA基因貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹節(jié)點支持率，低于0.50不顯示；標尺數字代表遺傳距離。圖1 基于16S rRNA序列的綠色裸藻類貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹The figures of the branch node represent the support rates of Bayesian tree based on 16S rRNA gene, and it is not displayed when lower than 0.50; the number of scale represents genetic distanceFig.1 Bayesian tree of green euglenophytes based on 16S rRNA sequence

圖2 基于表質硬化程度(Ⅰ)和表質條紋(Ⅱ)性狀的綠色裸藻類祖先重建結果Fig.2 Results of ancestral reconstruction about green euglenophytes based on degree of surface hardening (Ⅰ) and superficial stripe (Ⅱ)

圖3 基于后端形狀(Ⅰ)和囊殼及鞭毛孔結構性狀(Ⅱ)的綠色裸藻類祖先重建結果Fig.3 Results of ancestral reconstruction about green euglenophytes based on shape of posterior end (Ⅰ) and lorica and flagellar pore (Ⅱ)

圖4 基于鞭毛長度(Ⅰ)和葉綠體形狀(Ⅱ)的綠色裸藻類祖先重建結果Fig.4 Results of ancestral reconstruction about green euglenophytes based on length of flagella (Ⅰ) and shape of chloroplast (Ⅱ)

圖5 基于葉綠體蛋白核(Ⅰ)和副淀粉粒形狀及數量(Ⅱ)性狀的綠色裸藻類祖先重建結果Fig.5 Results of ancestral reconstruction about green euglenophytes based on pyrenoid of chloroplast (Ⅰ) and shape and quantity of paramylon grains (Ⅱ)

(7)葉綠體蛋白核 蛋白核是綠色裸藻類色素體中的重要結構，有的種類缺乏，有的種類存在，有蛋白核的種類，有的具副淀粉鞘，有的無。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結果(圖5)可以看出，無蛋白核這一性狀較穩(wěn)定而經歷了長的發(fā)展時期，蛋白核具鞘這一性狀也在祖先狀態(tài)中以一定頻率出現，但最原始的性狀可能是蛋白核無鞘這一性狀。

(8)副淀粉粒形狀及數量 副淀粉粒形狀及數量這一性狀表現穩(wěn)定，是綠色裸藻類種類鑒定的重要特征，表現為小顆粒狀且數量不定、具定形但不定數不定位的大顆?；蚓叨ㄐ味〝刀ㄎ坏拇箢w粒。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結果(圖5)可以看出，副淀粉粒為小顆粒狀且數量不定這一性狀相對原始。

2.3 基于祖先重建的綠色裸藻類植物原始性分析

李效宇等[42]研究表明，綠色裸藻不同種類的體表線紋在排列方向、形狀、粗細及疏密程度不同，而且這一性狀在同一定種內是相對穩(wěn)定的，因此可以作為分類的一個重要依據。本研究通過對表質條紋(圖2)的研究發(fā)現，對于光滑或不明顯，孔紋、點紋、凸紋或肋紋，縱線紋3種性狀來說，螺旋形線紋這一性狀更為原始，推測表現為螺旋形線紋的裸藻屬、眼裸藻屬、鱗孔藻屬和扁裸藻屬有可能是較早出現的綠色裸藻類。通過對表質硬化程度(圖2)的研究發(fā)現，對于形狀固定這一性狀來說，易變形的性狀更為原始，推測表現為易變形的裸藻屬、眼裸藻屬、雙鞭藻屬、擬雙鞭藻屬、囊裸藻屬、陀螺藻屬和盤裸藻屬有可能是較早出現的綠色裸藻類。對后端形狀的研究(圖3)發(fā)現，對于形狀不定、乳頭狀突出、圓形3種性狀來說，漸尖或尖尾刺這一性狀更為原始，推測表現為后端漸尖或尖尾刺的裸藻屬、眼裸藻屬、扁裸藻屬、陀螺藻屬、盤裸藻屬和旋形藻屬有可能是較早出現的綠色裸藻類。對囊殼及鞭毛孔的研究(圖3)可以看出，對于有囊殼無領，具或無加厚環(huán)；無領，具加厚環(huán)；具矮領，具或無加厚環(huán)；具領，領緣具齒刻四種性狀來說，無囊殼這一性狀更為原始，推測表現為無囊殼的裸藻屬、隱裸藻屬、柄裸藻屬、扁裸藻屬、鱗孔藻屬、雙鞭藻屬、旋形藻屬、擬雙鞭藻屬、眼裸藻屬和盤裸藻屬出現相對較早，而囊裸藻屬和陀螺藻屬出現較晚。對鞭毛長度的研究(圖4)可知，鞭毛長度在發(fā)展過程中，無特定的側重發(fā)展方向，各性狀出現頻率接近，不能推斷可能的祖先狀態(tài)。通過對葉綠體形狀的研究(圖4)發(fā)現，對于星狀、小盤狀、球形3種性狀來說，片狀、盾狀或大盤狀這一性狀更為原始，推測表現為葉綠體片狀、盾狀或大盤狀的囊裸藻屬、柄裸藻屬、隱裸藻屬、眼裸藻屬和裸藻屬可能較早出現。通過對葉綠體蛋白核的研究(圖5)發(fā)現，對于無蛋白核、蛋白核被副淀粉顆粒包圍、蛋白核具鞘3種性狀來說，蛋白核無鞘這一性狀更為原始，推測表現為具無鞘蛋白核的裸藻屬、囊裸藻屬和旋形藻屬有可能是比較原始的種類。通過對副淀粉粒形狀及數量的研究(圖5)發(fā)現，對于具定形但不定數不定位的大顆粒、具定形定數定位的大顆粒2種性狀來說，副淀粉粒為小顆粒狀且數量不定這一性狀更為原始，推測表現為副淀粉粒小顆粒狀且數量不定的裸藻屬、眼裸藻屬、雙鞭藻屬、擬雙鞭藻屬、囊裸藻屬、陀螺藻屬和柄裸藻屬植物較早出現。綜合8種性狀祖先重建結果來看，裸藻屬和眼裸藻屬植物具有所有原始性狀，可能是綠色裸藻類的祖先。

3 討 論

從研究結果看，雙鞭藻屬與擬雙鞭藻屬互為姐妹群，鱗孔藻屬和盤裸藻屬親緣關系較近，裸藻屬不是一個單系類群，這與之前有關文獻基于SSU rRNA的研究結果一致[19]。但扁裸藻屬、陀螺藻屬、隱裸藻屬、柄裸藻屬和旋形藻屬親緣關系則與文獻報道結果有出入。另外，有些不同屬親緣關系很近，同時有的屬內不同種類親緣關系較遠，出現這種現象可能是基于不同的基因會出現不同的結果。也有可能目前屬種的界定還不夠完善。因此，只有在更多分子序列數據的基礎上，才可能構建科學客觀的系統(tǒng)發(fā)育關系。

不同物種性狀的形態(tài)穩(wěn)定性對于重建復雜性狀的進化史是必要的，以形態(tài)性狀和分子數據相結合重建性狀的發(fā)展過程，是科學發(fā)展的必然[19]。施之新曾基于形態(tài)性狀，對裸藻類進行過分支分類分析，指出對于表質的硬化程度及變形這一性狀的極性是沿柔軟變形向高度硬化而不變形的方向發(fā)展，對于表質條紋這一性狀的極性是由螺旋形向縱向過渡，對于囊殼及鞭毛孔這一性狀的極性是由無囊殼向囊殼具領和加厚環(huán)過渡，對于副淀粉粒這一性狀的極性是由小顆粒狀且數量不定向具定形定數定位的大顆粒過渡[22]。本研究結果與其高度一致，可見基于葉綠體16S rRNA可以客觀反映綠色裸藻類的進化過程。

本研究所選擇的葉綠體16S rRNA基本上可以客觀反映綠色裸藻類系統(tǒng)發(fā)育關系，說明該基因是植物類群系統(tǒng)發(fā)育的有效分子標記之一，也說明了葉綠體基因在反映植物系統(tǒng)發(fā)育研究中的重要性。但是采用單一的分子標記也存在一定的缺陷。由于分子數據的局限以及分析方法存在一定程度的不足，因此祖先重建分析的結果可能只是基本上反映祖先性狀的演化過程。此外，還有一些其它性狀如細胞形狀、囊殼的分層以及囊殼的顏色等，雖然本研究尚未涉及，但是這些性狀在綠色裸藻類植物分類方面依然具有一定的價值。因此，進一步積累分子數據，更為合理地對形態(tài)性狀進行編碼，進一步正確評價性狀及其分類學或系統(tǒng)學意義，值得進一步深入研究。