匡 怡，沙毛毛，馬宏昕，任靜娜，饒本龍，薛文君，王嘉儀，許正新

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇 揚州 225000)

心肌細胞通過各離子通道調(diào)節(jié)跨膜離子的電位差，保持心臟功能狀態(tài)[1]。一旦心肌離子通道發(fā)生病變或動態(tài)平衡被打破，容易誘發(fā)多種心臟疾病，心律失常是最常見的表現(xiàn)形式。鈉、鉀、鈣等常見離子通道在心肌細胞膜上分布最為廣泛[2]。其中，電壓門控性鈉通道(voltage-gated sodium channel，VGSC)亦稱快鈉通道，該通道可引發(fā)心肌細胞動作電位，并完成心臟傳導(dǎo)，在維持心臟電生理過程中不可或缺[3]。鈉通道作為Ⅰ類抗心律失常藥物的作用靶點，但其治療效果不到60%，因此，尋求療效較好的抗心律失常新藥并揭示其機制，始終是熱點研究方向。

葛根是多年生落葉藤本豆科藥用植物野葛[Puerarialobate(Willd.) Ohwi]的干燥根[4]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，位列中品，性涼，味甘、辛，具有“解肌熱、止煩渴、瀉胃火”之效，作為中藥方劑的經(jīng)典配伍沿用至今，其發(fā)揮藥理活性的主要成分是異黃酮類化合物，包括葛根素、大豆苷元、染料木黃酮等[5]。文獻報道，大豆苷元(daidzein，DD)具有提高免疫、抗癌癥、抑制骨質(zhì)疏松、抗氧化、改善婦女經(jīng)期等多種藥理作用[6]。另有一些研究結(jié)果表明，在整體動物實驗中，DD可對抗異丙腎上腺素[7]、烏頭堿[8]、心肌缺血/再灌注損傷[9]等多種原因誘發(fā)的心律失常，能明顯縮小心肌梗死面積和抑制心肌肥厚。臨床使用黃豆苷元片治療高血壓病及癥狀性高血壓、冠心病和眩暈癥，但作用機制未明。有人推測DD的以上作用與其影響鈉通道有關(guān)[10]，但缺乏證據(jù)支持。本實驗運用全細胞膜片鉗技術(shù)，以急性分離的心肌細胞為樣本，直接觀察DD對大鼠心室肌細胞INa的影響，以期為其今后的進一步開發(fā)及其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1實驗動物SPF級成年SD大鼠，體質(zhì)量(250±50)g；出生d 1～3的SD乳鼠(♀♂兼用)，均由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心供應(yīng)，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2012-0004，使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0029。

1.2藥物與試劑DD (純度≥98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司)；?；撬帷EPES、葡萄糖(美國Sigma公司)；膠原酶II(美國Worthington Biochemical公司)；河豚毒素(tetrodotoxin，TTX) (上?？死敔栐噭┕?；DMEM、胎牛血清FBS(美國HyClone公司)。

1.3試劑配制無鈣臺式液(mmol·L-1):NaCl 136.0、KCl 5.4、HEPES 5.0、NaH2PO4·2H2O 0.33、MgCl2·6H2O 1.0、葡萄糖 10.0，pH值用NaOH調(diào)至7.34～7.38；臺式液：50 mL無鈣臺氏液中加1.8 mmol·L-1CaCl2即可；酶液：無鈣臺式液中加入0.5 g·L-1的膠原酶Ⅱ、1 g·L-1的BSA和30 μmol·L-1的CaCl2；細胞保存液(KB液，mmol·L-1)：L-谷氨酸70.0、?；撬?0.0、KCl 25.0、EGTA 0.5、HEPES 5.0、NaH2PO4·2H2O 10.0、葡萄糖 11.0、HEPES 5.0、KOH 89.0，pH值用KOH調(diào)至7.35～7.40；鈉電流電極外液(mmol·L-1)：NaCl 135.0、CsCl 5.4、CaCl22.4、MgCl22.1、CdCl20.35、HEPES 5.0、葡萄糖 11.0，pH值用NaOH調(diào)至7.40；鈉電流電極內(nèi)液(mmol·L-1)：CsCl 133.0、NaCl 5.0、EGTA 10.0、TEACl 20.0、HEPES 5.0、MgATP 5.0，pH值用CsOH調(diào)至7.37～7.38；DD溶于DMSO，其終濃度控制低于千分之一。

1.4儀器Patch clamp EPC 10膜片鉗儀(德國HEKA Instrument公司)；P-97微電極拉制儀、MP-225三維操縱器(美國Sutter Instrument公司)；IX71倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)；BSA124S電子天平(美國Sartorius公司)；DIGIDATA-1440 A/D-D/A 轉(zhuǎn)換器(美國Axon Instruments公司)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

2 方法

2.1乳鼠心肌細胞的分離和培養(yǎng)取SD乳鼠，浸泡75%乙醇中消毒，于無菌條件下開胸，取其心臟，在預(yù)冷的PBS中沖洗2～3次，將心肌組織剪成1 mm3的小塊，轉(zhuǎn)移至離心管中。加入0.25%的胰酶液，置37 ℃水浴箱中分4次消化，至出現(xiàn)拉絲絮狀白色組織塊。收集除第1次消化以外的細胞懸液于離心管中，離心5 min，棄上清液，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止對胰酶的消化，200目濾網(wǎng)過濾。再離心5 min，棄上清液，收集細胞，加入含有10%胎牛血清DMEM，制成單細胞懸液，靜置在37 ℃、5% CO2孵箱中，差速貼壁1.5 h,獲得高純度心肌細胞。后接種于培養(yǎng)皿中，隔24～48 h換液。

2.2MTT法檢測細胞活性于96孔板中每孔接種8 000～10 000個乳鼠心肌細胞，每孔100 μL。待細胞貼壁后，長滿至80%開始實驗。吸棄培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的DD溶液(0、1、3、10、30、100、300 μmol·L-1)，平行5孔。藥物分別作用24、48 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g·L-1)，置孵箱中培養(yǎng)4～6 h，棄上清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，經(jīng)搖床低速晃板10 min后。在酶聯(lián)免疫分析儀上490 nm波長處測A490，實驗重復(fù)3次，取平均值。

2.3心肌細胞的分離SD大鼠ip肝素鈉2000 IU·kg-1，約10 min后ip 1%戊巴比妥鈉(10 mL·kg-1)。待麻醉顯效后，將大鼠仰位固定于鼠臺，剪開胸腔充分暴露心臟，于降主動脈段快速剪下，置于4 ℃無鈣臺式液清洗，去除多余脂肪結(jié)締組織，用縫線結(jié)扎主動脈，固定在Langendorff灌注架上。用臺式液灌流，待心臟復(fù)跳2～3次后，隨后加預(yù)先以100% O2飽和的無鈣臺式液灌流5～10 min，再用酶液循環(huán)灌流20～30 min，直至心臟明顯脹大，觸感較軟，滴液渾濁微黃，即刻停止消化。實驗過程灌流液溫度維持在(37±0.5) ℃。在KB液中剪碎心肌組織，過濾，得單個游離心室肌細胞。于室溫中靜置10 min，棄上清液，加入KB液復(fù)懸，反復(fù)3次。

2.4INa記錄吸取細胞懸液于倒置顯微鏡培養(yǎng)皿中(皿中儲存1 mL細胞外液)，靜置5～10 min，待細胞貼壁后，選擇橫紋清晰、表面光滑、立體感強、靜息舒展的長桿狀心肌細胞進行后續(xù)實驗操作，實驗溫度保持(22～25) ℃，濕度20%～40%。為除去細胞間大小誤差，INa幅值用電流密度(pA/pF)來表示。

3 結(jié)果

3.1DD對乳鼠心室肌細胞活性的影響用酶解法急性分離乳鼠心肌細胞，培養(yǎng)24、48 h后，給予終濃度1、3、10、30、100 μmol·L-1的DD，MTT法測定細胞活力。如Fig 1所示，與對照組(0 μmol·L-1)相比，不同濃度的DD對乳鼠原代心肌細胞活力均有影響。當(dāng)細胞培養(yǎng)至24 h時，細胞活力在DD 1～100 μmol·L-1時有所降低，其中10 μmol·L-1時與對照組比較，細胞活力明顯降低(P<0.05)；當(dāng)細胞培養(yǎng)時間延長至48 h，與對照組相比，DD在1～10 μmol·L-1時，隨藥物濃度增加，心肌細胞活力明顯降低(P<0.05)，當(dāng)濃度增至30～100 μmol·L-1時，對心肌細胞活力的影響強度更明顯(P<0.01)；與24 h相比，細胞在48 h時，0～10 μmol·L-1DD差異無顯著性，30～100 μmol·L-1差異有顯著性，且隨藥物濃度增加，細胞活力明顯降低(P<0.05)。由此提示，此濃度范圍內(nèi)的藥物對細胞產(chǎn)生的毒性較大，DD的IC50在30～100 μmol·L-1。

3.2DD對心室肌細胞INa的影響為記錄DD對INa的影響，本實驗使用方波單刺激方案，給予指令電壓-80 ～20 mV，刺激脈寬30 ms，持續(xù)刺激時間20 ms的方波單刺激。Fig 2結(jié)果表明，可引出快速激活快速失活的的內(nèi)向電流，該電流幾乎可被15 μmol·L-1的高特異性鈉通道阻滯劑TTX阻斷，證實所記電流為INa。0.3 μmol·L-1DD作用后，INa明顯減小，待電流趨于穩(wěn)定后，用細胞灌流槽沖洗5 min，該電流逐漸恢復(fù)，表明INa的減小確是由藥物作用引發(fā)的。

Fig 1 Effects of different concentrations of daidzein on viability

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vs24 h

Fig 2 Effects of daidzein on single stimulation of INa

3.3不同濃度的DD對心室肌細胞INa的影響運用膜片鉗的全細胞模式，刺激方案同“3.2”，使用細胞累積加藥法，分別觀察DD在0.1、0.3、1、3、10 μmol·L-1濃度下對心室肌細胞INa的作用。Fig 3結(jié)果表明，當(dāng)給予DD 0.1 μmol·L-1后，其對INa影響微弱，而0.3、1、3、10 μmol·L-1的DD使得大鼠心室肌細胞INa從給藥前(-53.9±6.35) pA/pF分別降至(-33.78±3.24) pA/pF、(-25.16±4.24) pA/pF、(-22.28±3.54) pA/pF和(-17.96±4.56) pA/pF；與對照組相比，0.3、1 μmol·L-1低濃度的DD就具備抑制效果，且效果明顯(P<0.01)，其對INa的抑制率分別約為37%和53%，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示DD呈濃度依賴性抑制Na+通道電流，隨濃度增加，抑制作用愈強。

3.4DD對心室肌細胞INa時間過程的影響為探究DD對心室肌細胞INa時間過程的影響，采用刺激方案同“3.2”。當(dāng)0.3 μmol·L-1DD作用5 min后(Fig 4)，INa，peak明顯降低(a段)，并隨時間延長而減弱，后趨于穩(wěn)定，電流幅值幾乎不變(b段)。而在隨后的洗脫過程中(c段)，INa，peak逐漸恢復(fù)，其INa，peak在隨后的洗脫過程也是可逆的。

Fig 3 Effects of daidzein on INa，peak

**P<0.01vscontrol group

Fig 4 Effects of 0.3 μmol·L-1 daidzein

3.5DD對INa電壓(I-V)關(guān)系曲線的影響在電壓鉗模式下，保持初電位-80 mV，給予-70～90 mV、階躍5 mV、持續(xù)時間30 ms的方波串刺激，刺激頻率0.5 Hz，記錄給藥前后INa。以膜電位為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的鈉通道最大電流密度為縱坐標(biāo)繪制I-V曲線。Fig 5結(jié)果表明，1、3、10 μmol·L-1DD作用后，使I-V曲線明顯上移，INa漸漸減少，但不改變曲線形態(tài)、激活閾電位(-50 mV)、最大激活電壓(-20 mV)和反轉(zhuǎn)電位(95 mV)。給藥前，INa的最大電流密度在-20mV時為(-44.90±1.05) pA/pF，而在1、3、10 μmol·L-1DD的作用下，最大電流密度是(-22.30±2.03) pA/pF、(-15.41±1.58) pA/pF、(-12.45±2.35) pA/pF (P<0.01)。可見，隨濃度增加，最大電流密度明顯減小。

Fig 5 Effects of daidzein on I-V curve of INa before

**P<0.01vscontrol group

Tab 1 Effects of daidzein on recovery-related kinetic parameters after INa

Fig 6 Effects of daidzein on activation kinetics of

A:The effect of 1，3，10 μmol·L-1daidzein and daidzein eluted by extracellular fluid on the activated primary currents ofINa; B: The effect of 1，3，10 μmol·L-1daidzein on the steady-state activation curve ofINa.**P<0.01vscontrol group.

3.8DD對INa失活后恢復(fù)動力學(xué)的影響在電壓鉗模式下，采用雙脈沖刺激法，保持電位為-80 mV，給予去極化至-30 mV的刺激，刺激時間持續(xù)30 ms，回到保持電位持續(xù)5 ms后，再給予一系列去極化至-30 mV，30 ms的刺激，其中前后兩個脈沖的間隔時間以5 ms的幅度逐漸增加，共計15個脈沖，來引出鈉通道失活后恢復(fù)電流，以相對電流I/Imax為縱坐標(biāo)，各膜電位為橫坐標(biāo)作圖。依據(jù)One-phase association指數(shù)方程I/Ipre=1-exp(-t/τ)擬合，I/Ipre為后一個脈沖與前一個脈沖電流的比值，t為兩脈沖間的時間間隔，τ為通道失活后再激活至電流最大值的恢復(fù)時間。Fig 8、Tab 1結(jié)果顯示，DD使INa的失活后恢復(fù)曲線右移，而1 μmol·L-1DD使τ由給藥前(11.31±0.13) ms變?yōu)?13.30±0.24) ms；同樣給予3、10 μmol·L-1DD后，τ為(15.49±0.32) ms和(21.35±0.22) ms，恢復(fù)時間明顯延長(P<0.01)。結(jié)果表明，DD可改變INa的失活后恢復(fù)動力學(xué)特征，呈濃度依賴性延緩INa從失活態(tài)向激活態(tài)轉(zhuǎn)變。

Fig 7 Effects of daidzein on inactivation kinetics of

A:The effect of 1，3，10 μmol·L-1daidzein and daidzein eluted by extracellular fluid on the inactivated primary currents ofINa; B: The effect of 1，3，10 μmol·L-1daidzein on the steady-state inactivation curve ofINa.**P<0.01vscontrol group.

Fig 8 Effects of daidzein on recovery kinetics after INa

A:The effect of 1，3，10 μmol·L-1daidzein and daidzein eluted by extracellular fluid on the recovered primary currents ofINa; B: The effect of 1，3，10 μmol·L-1daidzein on the steady-state recovery curve ofINa.**P<0.01vscontrol group.

4 討論

根據(jù)WHO統(tǒng)計，在2015年，有70%的人死于非傳染性疾病，其中心血管疾病死亡人數(shù)達1 770萬(31%)，且約25%的患者死亡是由心律失常引起的[11]。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中也有許多關(guān)于心律失常的記載和描述，如《傷寒雜病論》中的“脈浮、心動悸、怔忡”，中醫(yī)脈學(xué)上的“促、結(jié)、遲、澀、芤脈”等，并留下了一些治療經(jīng)驗方，如炙甘草湯、安神丸、葛根芩連湯等。DD作為葛根芩連湯君藥葛根的有效活性成分，可對多種類型心律失常有治療作用[12]。眾所周知，心律失常發(fā)生的主要機制是心肌細胞自律性升高、心肌組織內(nèi)形成折返和出現(xiàn)后除極[13]，鈉通道是目前治療心律失常的主要靶點之一[3]。

MTT實驗結(jié)果顯示，DD的IC50在30～100 μmol·L-1，本實驗給藥終濃度設(shè)定為0.3～10 μmol·L-1。采用膜片鉗技術(shù)記錄DD對大鼠心室肌細胞INa特性，結(jié)果表明，DD對I-U曲線的幅值具有抑制作用，呈劑量依賴性阻滯Na+內(nèi)流；同時使其Na+通道激活過程緩慢，使通道開放程度降低，加快失活過程，明顯延長Na+通道從失活態(tài)到靜息態(tài)的恢復(fù)過程，即可延緩心室復(fù)極時INa的恢復(fù)，通過延長有效不應(yīng)期來抑制快速性心律失常，降低鈉通道的間隙興奮性，這與I類抗心律失常藥物鈉通道阻滯劑特性相關(guān)[3]，此分子水平的實驗結(jié)果也與整體動物實驗中DD的作用一致。因此，可以部分解釋其抗心律失常作用機制。

有研究證實[14]，DD溶液在體內(nèi)吸收迅速，表明其在急性心肌缺血和腦缺血等疾病中實用性較強，主要優(yōu)先分布于心、腦、肝等臟器中，顯示其在治療心腦血管疾病較高特異性。另有文獻報道[6]，DD也是一類天然植物雌激素，與哺乳動物雌激素17-β雌二醇的結(jié)構(gòu)特征存在共性：有一對間距相近的羥基基團及一個酚環(huán)，這類結(jié)構(gòu)的相似性決定了DD具有一定雌激素效應(yīng)，雌激素在體內(nèi)和體外可調(diào)節(jié)心肌細胞存活、抑制細胞凋亡等相關(guān)蛋白質(zhì)的表達和激活，從而產(chǎn)生心臟保護作用，尤其可對過氧化物所致心肌缺血/再灌注的損傷起到保護作用。心肌缺血/再灌注損傷時，由于缺血心肌ATP生成減少，使得細胞膜上鈉泵功能減弱，致大量Na+內(nèi)流至細胞內(nèi)，易引起細胞水腫，此時Na+可激活細胞膜上的Na+-Ca2+交換，造成Ca2+跨膜通透性增加和內(nèi)流超負荷。而且由于缺血心肌內(nèi)酸中毒，在此過程中產(chǎn)生氧自由基(主要是OH-)，使得Na+-H+交換系統(tǒng)被激活，Na+-H+交換在排出細胞內(nèi)H+的同時，大量Na+內(nèi)流至細胞內(nèi)，由此又在后除極達到閾電位水平后引起新的動作電位[15]。已知，目前的心臟活性藥物幾乎沒有對一種離子通道具有絕對選擇性，科學(xué)家通過構(gòu)建Cav1.2和Nav1.5通道蛋白模型，發(fā)現(xiàn)鈉鈣通道之間存在結(jié)構(gòu)相似性，很好地解釋其發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性[16]。

綜上所述，DD可能是對大鼠心室肌細胞Na+通道電流具有抑制效應(yīng)，從而發(fā)揮抗心律失常的作用。后期可在古方基礎(chǔ)之上繼續(xù)深入挖掘，從心室肌細胞鈣通道和鉀通道等多種途徑，系統(tǒng)探究該藥能影響離子通道的哪些亞型，為該藥的進一步開發(fā)、利用及更好地指導(dǎo)臨床用藥提供理論依據(jù)。

(致謝：本實驗在揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院細胞膜片鉗室和藥學(xué)實驗中心完成，感謝本課題組老師和全體同學(xué)的指導(dǎo)與幫助)