于慧檸 鄭體花 鄭慶印

濱州醫(yī)學院(煙臺264003)

隨著經(jīng)濟發(fā)展和醫(yī)療技術進步，人們的生活水平日益提高，人均壽命不斷延長，隨之而來的是人口老齡化和年齡相關性疾病發(fā)病率的升高。年齡相關性聾 (Age-related hearing loss，ARHL)是其中所占比重較大的疾病之一。美國最新人口普查數(shù)據(jù)顯示，到2030年65歲以上人口數(shù)量將達到7300萬。其中有4100萬人會存在聽力損失，占65歲以上人口的56.2%[1]，其中，65歲以上人群中的發(fā)病率約25%-40%，75歲以上人群發(fā)病率為40%-66%，而85歲以上的人群發(fā)病率高達80%[2]。據(jù)報道，2025年到2040年之間，我國老年人口將從2.84億達到4億，其中有11.04%為聽力殘疾，致殘原因中，ARHL占66.78%[3]。耳聾不僅影響了患者本身的生活質量，使患者變得孤立、抑郁，同時由于溝通困難失去生產(chǎn)力而對社會造成的間接損失也不容忽視[4]。目前為止，聽覺輔助裝置是防治ARHL最主要的方法，但由于其價格因素，在國內老年性聾人群中應用明顯受限[5]。因此，加快尋找明確的發(fā)病機制是研究防治ARHL的重要途徑。氧自由基（Reactive oxygen species,ROS）過量累積導致衰老性疾病的理論在很多研究中得到了共識，在ARHL發(fā)病機制的研究中氧化應激通路也受到了廣泛關注。

1 氧化應激與衰老

氧化應激產(chǎn)生的自由基包括氧自由基和氮自由基，其中對ROS的研究相對較多。ROS可產(chǎn)生于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化還原反應、一氧化氮合成中，也可產(chǎn)生于線粒體、微粒體、過氧化物酶進行正常生理活動的進程中。盡管低濃度的ROS對機體傳遞能量、保持活力、殺死細胞、消除炎癥和分解毒素等而言是必須的，但異常高水平的ROS則變成“污染物”[6]，機體內抗氧化酶和ROS的平衡被打破可引起組織的病理改變。在組織內ROS可使酶失活，破壞DNA成片段，攻擊不飽和脂肪酸，形成脂質過氧化物，形成的脂質過氧化物又可以引發(fā)臨近的不飽和脂肪酸的鏈式反應，通過與脂質、蛋白質、核酸反應，抑制DNA復制及轉錄并產(chǎn)生乙二醇胸腺嘧啶及8-脫氧鳥苷，兩者都是氧化性DNA損傷的直接產(chǎn)物[7]。

ROS過量累積導致衰老性疾病的理論在很多研究中得到了共識，如：糖尿病、癌癥、心血管疾病、帕金森病和阿爾茨海默病等[8]。研究表明，過量累積的ROS也是導致應激介導的耳聾的重要病理機制[9]，如噪音性聾[10]、藥物性聾[11]、耳鳴[12]、老年性聾。機體無時無刻不存在ROS的產(chǎn)生，即便是身體狀況一直健康的老年人在65歲之后也會出現(xiàn)耳聾的癥狀，這說明隨著年齡的增長而累積的ROS與ARHL的發(fā)生密切相關。因此ROS介導的氧化應激是研究ARHL必不可少的通路。

2 年齡相關性聾

ARHL臨床上又稱老年性聾（Presbycusis），發(fā)病從高頻聽力損失開始，逐漸累積低頻聽力，以聽覺靈敏度降低為主，伴隨著言語識別力的下降，是雙耳對稱出現(xiàn)并緩慢發(fā)展的一種疾病，其具體的分子機制目前尚不清楚，被認為是一種多因素共同作用的疾病，致病危險因素包括外因(噪音，藥物，創(chuàng)傷，血管損傷，代謝變化和免疫系統(tǒng)疾病)、內因、遺傳、基因等[13,14]。Schuknecht[15]提出的臨床常見的四種主要類型的ARHL，每一種都有不同的聽覺表征：1.感音性：耳蝸底回毛細胞退行性變，高頻聽力損失；2.神經(jīng)性：螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元丟失，言語識別力降低；3.代謝性：血管紋萎縮，純音聽力圖低平；4.機械傳導性：基底膜柔韌性降低，能量的機械傳導受損。在這4種類型獨立的分型比較少見，大部分ARHL的臨床類型是兩種或者兩種以上的混合類型，這樣的分型與其病理分型有關。ARHL的病理學特點包括毛細胞丟失、血管萎縮、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的喪失以及中樞聽覺通路的退化，大多數(shù)的ARHL病例都是這些病理變化的混合物[16]。

目前的研究表明，氧化應激和mtDNA損傷是ARHL的重要機制之一[9,17]，二者相輔相成，相互聯(lián)系共同作用于毛細胞的凋亡過程。有學者認為氧化應激產(chǎn)生大量的ROS,ROS誘導細胞凋亡又分為內、外兩種途徑[18]，細胞外途徑即ROS直接損傷細胞，通過刺激細胞外的跨膜受體激活Caspase8和下游的Caspase3啟動了細胞凋亡；細胞內途徑則通過線粒體發(fā)揮損傷作用，線粒體除了細胞膜通透性改變，激活了Caspase9和其下游效應因子細胞色素酶c引起細胞凋亡外，還釋放了大量的ROS，如此惡性循環(huán)加重了聽覺感受細胞不可逆凋亡的進程，使得ARHL一旦發(fā)生便無法逆轉[18]。

3 氧化應激與ARHL的研究進展

3.1 氧化應激與ARHL

如前所述，ARHL的發(fā)生與毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)不可逆的凋亡密切相關[16]。目前多數(shù)實驗數(shù)據(jù)表明，ARHL的患者或動物模型體內氧化應激相關蛋白或因子的表達量升高而抗氧化相關蛋白或因子含量明顯下調，證實了ARHL與氧化應激存在一定的密切關系。

Neri等[19]在老年耳聾患者頸靜脈中檢測到高水平表達的丙二醛（MDA）和4羥基壬烯酸（4-HNE），而這兩個指標是反映氧化應激水平的標志物，表達量升高可能與內皮組織易遭受氧化應激產(chǎn)物攻擊有關；Jiang等[20]利用谷胱甘肽共軛標記蛋白監(jiān)測到H2O2介導的氧化應激水平在CBA∕J小鼠12月齡表達升高，4-HNE、硝基酪氨酸（3-NT）等羥自由基和過氧硝酸鹽的產(chǎn)物在18月齡表達升高，23月齡后在螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋和螺旋韌帶被檢測到。除了ROS外，NOS也與ARHL有關，NO是一種潛在的神經(jīng)毒素，過量產(chǎn)生的NO可作為自由基本身或在誘導型一氧化氮合酶（Inducible Nitric-Oxide Synthse，iNOS）作用下與O2-結合形成過氧亞硝基，老齡的大鼠耳蝸中iNOS的表達量明顯高于幼齡鼠[21]。

與氧化應激相關因子表達上調相反的是，抗氧化系統(tǒng)相關因子在老年性耳聾發(fā)生時其表達量明顯下調，例如在Jiang等[20]的實驗中觀察到凋亡誘導因子和超氧化物歧化酶在CBA∕2J小鼠18月齡Corti氏器和螺旋神經(jīng)節(jié)中表達量下降。Liu等[22]認為正常情況下耳蝸中存在兩類抗氧化酶：與谷胱甘肽還原酶代謝相關的谷胱甘肽過氧化物酶-1(GPX1)、谷胱甘肽還原酶(GSR)和谷胱甘肽轉移酶(GST)；與分解超氧陰離子和過氧化氫相關的過氧化氫酶（CAT）和Cu∕Zn超氧化物歧化酶（SOD1），如果抗氧化酶功能受損則會導致細胞損傷。動物實驗證明，敲除Gpx1和Sod1基因的小鼠模型對年齡相關性聾和噪音性聾更易感[23-25]。GST是已知的由多個基因編碼的、發(fā)揮抗氧化作用和解毒作用的超家族酶的總稱，可能也發(fā)揮了保護毛細胞的作用[26]，其中GSTM1和GSTT1是GST家族系統(tǒng)遺傳學的主要研究對象，編碼GSTM1和GSTT1的基因在人群中存在基因變異，多達50%的ARHL人群存在GSTM1無效表型[27]，這種突變使得抗氧化酶與代謝產(chǎn)物無法準確結合，導致基因突變攜帶者更容易遭受氧化應激損傷，而且GSTM1基因突變攜帶者與正常人相比，高頻聽力的振幅更小，因而可能更易感年齡相關性聾[28]。除此之外，維生素A和鋅具有抗氧化衰老的功效，Lasisi等[29]研究了126例老年性耳聾患者的血清發(fā)現(xiàn)，高頻聽力損失的老年性耳聾患者血清里的維生素A和鋅的含量顯著降低。

正常情況下機體產(chǎn)生的ROS能被內源性抗氧化酶如過氧化物歧化酶、谷胱甘肽等清除，從而保持組織所處微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[30]。隨著年齡的增長，衰老打破了這個平衡，使得ROS不能被充分清除，過量積累的ROS攻擊靶點線粒體，造成線粒體內膜的損傷，影響跨越線粒體膜的質子濃度梯度，使線粒體合成ATP的功能受損；同時，線粒體功能受損使生成的ROS增多，不能被及時清除，造成生物膜結構蛋白質和脂質過氧化，損傷生物膜通透性，引起電子傳遞連的活性進一步下降，形成的惡性循環(huán)最終引起細胞凋亡[31]。因此，氧化應激不僅能直接造成毛細胞凋亡，還能通過攻擊線粒體造成損傷。

3.2 mtDNA損傷與ARHL

線粒體功能紊亂在聽力損失中的作用得到了證實：Sediman等[7]在老年性耳聾患者的顳骨切片中檢測到了mtDNA的缺失；我國學者韓維舉等[32]通過采用基因重組，聚合酶鏈式反應等技術，檢測到老年性耳聾患者組和老年正常聽力組mtDNA4977表達量存在差異，老年性耳聾患者組mtDNA4977的缺失率明顯高于老年正常聽力組，兩組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學差異。劉俊等[33]在Wistar大鼠模型上檢測mtDNA4977同源基因mtDNA4834發(fā)現(xiàn)，與青年大鼠相比，老年大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)和耳蝸核中mtDNA4834缺失率分別為66.7%和100%，而青年大鼠無mtDNA4834的缺失。

考慮到以人為老年性耳聾疾病研究對象的局限性，建立相關動物模型更利于研究。動物實驗證明，敲除與線粒體相關的某些因子后，實驗動物的聽力與正常組相比明顯下降[34]，例如mtDNA聚合酶Polg負責線粒體的復制和修復，Polg基因敲除的小鼠衰老速度要明顯快于正常小鼠，同時伴有聽力損失[35]。谷胱甘肽過氧化物酶1（Gpx1）通過降低過氧化氫的含量而在線粒體抗氧化防御中發(fā)揮重要作用，Gpx1基因敲除小鼠與正常小鼠相比更易感噪聲性聾。除了上述的動物模型以外，長期注射D-半乳糖(D-gal)的大鼠最近被用作老化或抗老化藥理學研究的動物模型[36]。長期注射D-gal可以誘導mtDNA4977缺失，模仿哺乳動物的自然老化過程[37]。Chen等[38]認為D-gal誘導的老化大鼠模型內耳的抗氧化酶活性降低，脂質過氧化顯著，聽力水平較正常大鼠明顯降低。此外，在老化大鼠模型的聽覺皮層、耳蝸核和下丘上也發(fā)現(xiàn)了mtDNA的缺失。眾多對mtDNA突變的研究顯示，線粒體功能紊亂嚴重影響了聽力水平。

那么ROS的產(chǎn)生和線粒體損傷存在怎樣的聯(lián)系呢？

線粒體是有氧活動的供能者和細胞死亡的調解者。它既可以利用氧進行氧化磷酸化形成ATP供能，又是ROS損傷的靶點，還能在此過程中產(chǎn)生ROS破壞細胞[31]。人類的每個細胞都含有大量的線粒體，毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和血管紋中的含量更多，是高氧代謝需求器官，且毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞均為終端分化細胞，數(shù)量有限且不可再生，mtDNA突變極易在這兩種細胞中累積[39]。隨著年齡增加和機體衰老的發(fā)生，內耳供血供氧不足，線粒體作為有氧代謝的主要場所對缺血缺氧十分敏感，加上局部ROS的大量累積，線粒體功能受損明顯，起初ATP產(chǎn)生低下，依靠ATP的生理活動受抑制，離子運輸紊亂、聲信號轉導效率降低，聽覺出現(xiàn)異常；隨著mtDNA突變率增加，最終啟動了細胞凋亡程序導致了毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡[40]，造成了ARHL不可逆轉的發(fā)生。Someya[41]的實驗也驗證了ROS和mtDNA損傷的存在一定聯(lián)系，過表達線粒體過氧化氫酶的轉基因小鼠（MCAT）與正常野生型小鼠相比毛細胞缺失率下降，DNA損傷減少，ARHL的發(fā)病時間明顯延緩。

4 抗氧化劑與ARHL

無論是ROS的直接作用還是通過損傷mtDNA間接誘導細胞凋亡，多數(shù)研究證實了ROS參與并介導了ARHL的發(fā)生發(fā)展，那么阻止或延緩ROS的過量積累也許是預防或治療ARHL的一種方法。

預防ARHL是一個相對較新的研究領域。在過去的幾年里，研究人員試圖阻止或減緩ARHL的發(fā)病或進展，主要方法包括增強機體內抗氧化防御系統(tǒng)能力和增加外源性抗氧化劑。關于補充抗氧化劑干預ARHL的基本觀點來自于幾個以人群為對象的研究，這些研究表明飲食中的維生素攝入量與ARHL的患病率有顯著的相關性[42]。然而更多的抗氧化劑的聽力保護作用實驗還是以動物模型作為研究對象。Seidman曾進行過一項隨機前瞻性研究[43]，對344只Fischer大鼠持續(xù)喂養(yǎng)維生素E（VE）、維生素C(VC)、拉扎洛依（預防阿爾茲海默癥藥物）和褪黑素，觀察小鼠體內抗氧化水平和聽力損失情況，發(fā)現(xiàn)喂食抗氧化劑的動物聽力水平要高于正常喂食的動物。VE是一種有效的脂溶性抗氧化劑，易提供氫原子來終止氧化鏈式反應，且對保護循環(huán)脂蛋白以及細胞膜的正確功能和穩(wěn)定性也至關重要。VC或抗壞血酸是一種水溶性維生素，它是超氧化物、硫醇、單基氧和羥基自由基的有效清除劑。褪黑素能直接中和羥基自由基和過氧化自由基，還能通過激活GSH過氧化物酶，抑制一氧化氮合酶的活性，起到間接抗氧化的作用。拉扎洛依通過抑制脂質過氧化、維持細胞膜中VE含量、增加細胞表面黏度等來增加細胞膜的穩(wěn)定性。2002年Seidman等[44]又探討了卵磷脂與ARHL的關系。卵磷脂是一種多不飽和的磷脂酰膽堿，它在激活大量的膜定位酶中發(fā)揮限速作用，其中包括SOD和GSH，是保護細胞膜免受ROS損傷的重要抗氧化劑。Seidman指出，所有抗氧化劑治療組，包括VE、VC、褪黑素、拉扎洛依、以及卵磷脂，都有較好的聽覺敏感性，與安慰劑組相比，mtDNA缺失的更少。補充VC的實驗組動物聽閾甚至下降了10dB。另有研究表明，抗氧化劑α-硫辛酸和輔酶Q10可減少耳蝸毛細胞的死亡并有效預防或延緩老年性耳聾的發(fā)生[45,46]。α-硫辛酸是一種親脂的自由基清除劑，具有低毒性和高滲透性，易穿過血腦屏障，能明顯降低Wistar大鼠內耳mtDNA4834 bp的缺失，提高了老年受試鼠的聽力水平；輔酶Q10是一種線粒體輔酶，對ATP的產(chǎn)生至關重要。最新研究發(fā)現(xiàn)，給Ggt1dwg∕dwg小鼠喂食N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可有效保護毛細胞，延緩毛細胞的凋亡[47]。NAC具有較強的抗氧化性能，能有效清除活性氧。NAC還上調了GSH和谷胱甘肽過氧化物酶的含量，通過防止脂質過氧化而抑制了ROS的生成。另外，某些具有抗氧化作用的中藥成分也用來研究對ARHL的預防作用，例如，葡萄籽提取物低聚原花青素對Wistar大鼠老年性耳聾的發(fā)生具有延緩作用[48]。因此，以氧化應激為靶點的抗氧化藥物也許能為延緩ARHL尋找新的治療方法。

雖然目前已經(jīng)構建了大量的動物模型來尋找ARHL最佳的預防和治療策略，但是不同鼠種模型之間存在高度變異性，目前尚不清楚哪一類模型與人類老年性耳聾最相似。抗氧化劑治療ARHL在人群中的首次研究是在一組40人的老年人中進行的[49]，研究表明實驗組人群在服用VE和VA 28-48天后聽力得到了改善。另有一項臨床試驗數(shù)據(jù)顯示，在服用VC 8-52周后服藥組的聽力損失要比對照組低約5 dB。Durga等[50]對728名ARHL患者中進行了3年的跟蹤試驗發(fā)現(xiàn)，服用葉酸組的患者與對照組患者相比，低頻聽力閾值有細微的差異，且具有統(tǒng)計學意義。

抗氧化劑治療ARHL真的有效嗎？縱觀近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，雖然大多數(shù)實驗表明，補充抗氧化劑可以有效延緩ARHL的發(fā)展，但仍有部分實驗數(shù)據(jù)表明抗氧化劑的作用并不顯著。Kashio等[51]的實驗表明，即使給C57BL∕6小鼠補充了抗氧化劑VC，也并沒有在小鼠的耳蝸內檢測到VC濃度的提高，也沒有觀察到ARHL的延緩。Bielefeld等[52]設計不同劑量的抗氧化劑乙酰肉堿對Fischer 344∕NHsd大鼠進行試驗，結果證明，乙酰肉堿并不能改善ARHL。Polanski在一項雙盲隨機臨床試驗中，對銀杏干提取物、α-硫辛酸、VC、VE的抗氧化效果進行對比，發(fā)現(xiàn)實驗組人群聽力閾值與安慰劑組的相比并沒有統(tǒng)計學差異[53]。分析這些差異的原因，可能與實驗所用模型、抗氧化劑藥物特性、給藥劑量、給藥持續(xù)時間等都有關系。

5 總結與展望

氧化應激是大多數(shù)衰老性疾病的共同通路，但其確切的發(fā)病機制仍不清楚。近年來隨著新技術的出現(xiàn)，基因治療和干細胞治療發(fā)展勢頭迅猛，基礎的藥物治療研究并沒有太多進展，美國NIDCD發(fā)布的2017-2021年工作指南中提出尋找ARHL的發(fā)病機制仍是未來聽力研究方向的重點。因此探索氧化應激通路在ARHL發(fā)病中的明確機制具有重要意義。