宗凌 姜鴻彥

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科

2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，中山大學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)研究所

3海南省人民醫(yī)院耳鼻咽喉醫(yī)院

胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化的研究已經(jīng)較為深入，擬胚體能再現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞分化的許多事件[1-3]。Okabe等將胚胎干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)形成擬胚體，表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的共同前體細(xì)胞的專一性標(biāo)志Nestin，這些Nestin陽(yáng)性細(xì)胞可誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[4]。通過(guò)擬胚體途徑進(jìn)行胚胎干細(xì)胞分化誘導(dǎo)，是胚胎干細(xì)胞神經(jīng)元分化采用最廣的策略。

羊水干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞，具有與胚胎干細(xì)胞相似的體外增殖和分化能力[5-10]；與胚胎干細(xì)胞體外移植不同，羊水干細(xì)胞接種活體動(dòng)物不具有致瘤性，有望成為一種新的干細(xì)胞庫(kù)[11]。羊水干細(xì)胞體外懸滴培養(yǎng)，可形成與胚胎干細(xì)胞相似的擬胚體[12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：人來(lái)源的羊水干細(xì)胞，接種于基底膜組織來(lái)源的內(nèi)耳干細(xì)胞空心球體制備的飼養(yǎng)層上，飼養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)內(nèi)耳支持細(xì)胞標(biāo)志物P27kip1，形成支持接觸的三維培養(yǎng)模式。不添加外源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子及神經(jīng)元信號(hào)誘導(dǎo)因子，DMEM∕F12培養(yǎng)6天，羊水干細(xì)胞定向分化為功能性神經(jīng)元，并表達(dá)聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元標(biāo)記物GATA-3[13]。對(duì)于未經(jīng)酶解消化制備飼養(yǎng)層的基底膜片段組織，是否依然對(duì)羊水干細(xì)胞具有神經(jīng)誘導(dǎo)作用，目前仍未明確。羊水干細(xì)胞能形成與胚體干細(xì)胞相似的擬胚體，而擬胚體經(jīng)誘導(dǎo)能定向分化為神經(jīng)元。有研究表明，耳蝸毛細(xì)胞的存在對(duì)聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元的存活是必需的[14-16]。因此，本研究擬將耳蝸基底膜組織與羊水干細(xì)胞擬胚體共培養(yǎng)，不添加神經(jīng)生長(zhǎng)因子及神經(jīng)元信號(hào)誘導(dǎo)因子，觀察耳蝸基底膜組織能否誘導(dǎo)擬胚體細(xì)胞分化為形態(tài)典型的神經(jīng)元。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新生小鼠(C57BL∕6J，出生1-3天內(nèi))，由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 羊水取自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳聾基因產(chǎn)前檢查家庭，夫妻雙方均簽署了知情同意書。在孕期19-22周期間，經(jīng)B超引導(dǎo)下，抽取孕婦羊水10ml，羊水由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供；中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并同意此項(xiàng)研究。

1.1.3 主要試劑：α-MEM medium、胎牛血清（FBS）購(gòu)于GIBCO公司，Chang B培養(yǎng)基、Chang C培養(yǎng)基購(gòu)于Irvine Scientific公司，Tuj1一抗、Sox2一抗購(gòu)于Abcam公司，Nestin一抗購(gòu)于Santa cruz公司，c-Kit磁珠抗體購(gòu)于MiltenyiBiotec公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離并培養(yǎng)擴(kuò)增羊水干細(xì)胞

用磁珠抗體分選羊水中具有c-Kit標(biāo)記的羊水干細(xì)胞，培養(yǎng)并傳代羊水干細(xì)胞[11,13]。

1.2.2 羊水干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)

收集羊水干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用增殖培養(yǎng)基(a-MEM medium+15%FBS+1%谷氨酰胺+18%ChangB+2%ChangC)重懸羊水干細(xì)胞，40μl（4×103個(gè)羊水干細(xì)胞）為每個(gè)懸滴體積，接種于60mm直徑培養(yǎng)皿蓋上，將蓋子翻轉(zhuǎn)并放置在充滿PBS緩沖液的培養(yǎng)皿上，每隔兩天半量換液[12]。

1.2.3 免疫熒光

鑒定擬胚體細(xì)胞，神經(jīng)干性標(biāo)記物Nestin、Sox2的表達(dá)。

1.2.4 耳蝸基底膜培養(yǎng)

將小鼠斷頭后，充分暴露顱底，取出聽(tīng)泡移入Hanks培養(yǎng)液，在解剖顯微鏡下取出全耳蝸基底膜，用尖刀切取基底膜片段。取1ml無(wú)血清培養(yǎng)液，加入到鼠尾膠包被好的的培養(yǎng)皿中，將組織塊移入，并使其下沉到培養(yǎng)皿底部。無(wú)血清培養(yǎng)液配方如下：DMEM+1%serum-free supplement(sigma I-1884)+2.4%葡萄糖（sigma G-2020）+1%谷氨酰胺，隔日更換培養(yǎng)液[17]。

1.2.5 共培養(yǎng)

耳蝸基底膜培養(yǎng)24小時(shí)后，可見(jiàn)組織生長(zhǎng)良好，外周有明顯新生上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞；將羊水干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)4天，形成的擬胚體移入基底膜培養(yǎng)皿中，換用DMEM∕F12培養(yǎng)液；此時(shí)開始用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞，以捕獲出現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞（細(xì)胞突起長(zhǎng)度為胞體直徑的5倍以上）的最初時(shí)間；耳蝸基底膜與擬胚體共培養(yǎng)6天（前期研究：將羊水干細(xì)胞接種于基底膜組織來(lái)源的空心球體制備的飼養(yǎng)層，形成支持接觸的三維培養(yǎng)模式，DMEM∕F12僅培養(yǎng)6天，即可見(jiàn)大量形態(tài)典型Tuj1陽(yáng)性神經(jīng)元[13]），檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj1的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）來(lái)表示,采用One-way ANOVA檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)輸入SSPSS 17.0，P＜0.05為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羊水干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)可形成擬胚體樣結(jié)構(gòu)

我們前期已成功分離并培養(yǎng)羊水干細(xì)胞，多次傳代干性穩(wěn)定；羊水干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)1天后，可見(jiàn)部分細(xì)胞聚集形成擬胚體，此時(shí)結(jié)構(gòu)較疏松，邊緣不整齊（圖1A）；將羊水干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)4天(圖1B)，可以形成類似于胚胎干細(xì)胞的擬胚體，胚體飽滿，邊界清楚，其內(nèi)細(xì)胞連接緊密，生長(zhǎng)旺盛，呈立體球形結(jié)構(gòu)，外形極其規(guī)整(圖1C)，形成率96%。

圖1羊水干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)形成擬胚體A懸滴培養(yǎng)1天；B懸滴培養(yǎng)4天；C放大圖，可見(jiàn)規(guī)整的立體球形結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺：A,B=100μm;C=25μm。Fig.1 Amniotic fluid stem cells were cultured by hanging-drop to form embryoid body like structures.(A)hanging drop culture for 1 day;(B)hanging drop culture for 4 days;(C)magnified picture,show uniform three-dimensional spherical structure.Bar:A,B=100μm;C=25μm.

2.2 擬胚體表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物

羊水干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)4天，形成擬胚體，表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、Sox2（圖2），表明該擬胚體具有神經(jīng)前體細(xì)胞特征[18]。of neural stem cell.(A)Nestin;(B)Sox2.Bar:A,B=50μm.

圖2羊水干細(xì)胞擬胚體表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物A Nestin；B Sox2。標(biāo)尺：A,B=50μm。Fig.2 Amnioticfluidstemcellscouldformembryoidbody-like structures by hanging drop culture,which express the marker

2.3 共培養(yǎng)

將懸滴培養(yǎng)4天形成的擬胚體與耳蝸基底膜組織共培養(yǎng)，用DMEM∕F12貼壁分化6天(圖3A)，擬胚體細(xì)胞有神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj1的表達(dá)（圖3B），呈現(xiàn)紅色熒光，多分布于克隆邊緣，胞體為橢圓形，呈梭形成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，無(wú)典型的神經(jīng)元形態(tài)特征(圖3C)(以細(xì)胞突起長(zhǎng)度為胞體直徑5倍以上的神經(jīng)樣細(xì)胞表型作為形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)），突起長(zhǎng)度僅為18±4.7μm；將Wnt-1基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染羊水干細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)Wnt-1的單克隆形成擬胚體，與耳蝸基底膜組織共培養(yǎng),同樣無(wú)形態(tài)典型的神經(jīng)元產(chǎn)生。

圖3羊水干細(xì)胞擬胚體與耳蝸基底膜組織共培養(yǎng)，DMEM∕F12分化6天，(A)擬胚體與耳蝸基底膜共培養(yǎng)；(B)擬胚體表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj1，但無(wú)典型的神經(jīng)元形態(tài)特征；(C)放大圖，可見(jiàn)Tuj1，呈現(xiàn)紅色熒光，多分布于克隆邊緣。標(biāo)尺：A=100μm;B=50μm C=25μm。Fig.3 The embryoid body were co-cultured with the organ of corti for six days by DMEM/F12.(A)embryoid body co-cultured with the organ of corti;(B)embryoid body had the expression of Tuj1,but no typical neuronal morphological feature;(C)magnified picture,the red fluorescence of Tuj1 were mostly localized on the edge of the clone.Bar:A=100μm;B=50μm C=25μm.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，將羊水干細(xì)胞體外懸滴培養(yǎng)，可形成形態(tài)均一且具有神經(jīng)干性的擬胚體，表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、Sox2。與耳蝸基底膜組織共培養(yǎng)，擬胚體細(xì)胞雖表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj1，但突起長(zhǎng)度僅為18±4.7μm，無(wú)典型的神經(jīng)元形態(tài)特征，說(shuō)明與耳蝸基底膜共培養(yǎng)的模式不能誘導(dǎo)擬胚體細(xì)胞向形態(tài)典型的神經(jīng)元分化。而我們前期研究證實(shí)，羊水干細(xì)胞接種于基底膜組織來(lái)源的內(nèi)耳干細(xì)胞空心球體制備的飼養(yǎng)層上，飼養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)內(nèi)耳支持細(xì)胞標(biāo)志物P27kip1，不添加外源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子及神經(jīng)元信號(hào)誘導(dǎo)因子，支持接觸三維培養(yǎng)模式下，羊水干細(xì)胞可以定向分化為功能性神經(jīng)元，并表達(dá)聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元標(biāo)記物GATA-3，神經(jīng)突起平均長(zhǎng)度91.3μm[13]。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，羊水干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，可能不依賴于基底膜來(lái)源的細(xì)胞分泌的可溶性神經(jīng)生長(zhǎng)因子及信號(hào)誘導(dǎo)因子，而是通過(guò)細(xì)胞間的支持接觸，耳蝸基底膜來(lái)源的內(nèi)耳支持細(xì)胞提供的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促使羊水干細(xì)胞定向分化為功能性神經(jīng)元[13]。

羊水干細(xì)胞接種在基底膜來(lái)源的內(nèi)耳干細(xì)胞空心球體制備的飼養(yǎng)層上，無(wú)需添加外源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子及信號(hào)誘導(dǎo)因子，可定向分化為功能性聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元；而羊水干細(xì)胞擬胚體與基底膜片段組織共培養(yǎng)，無(wú)法產(chǎn)生形態(tài)典型的神經(jīng)元。推測(cè)羊水干細(xì)胞與基底膜來(lái)源的飼養(yǎng)層細(xì)胞間的直接接觸是羊水干細(xì)胞分化為聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元的前提條件。這種接觸不僅僅是二維的接觸（將羊水干細(xì)胞擬胚體與耳蝸基底膜片段組織共培養(yǎng)），更需要將羊水干細(xì)胞接種在基底膜來(lái)源的內(nèi)耳干細(xì)胞空心球體制備的飼養(yǎng)層表面（羊水干細(xì)胞與飼養(yǎng)層細(xì)胞有支持接觸的關(guān)系），形成立體三維結(jié)構(gòu)模式。研究表明，毛細(xì)胞的存在對(duì)聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元的存活是必需的[14-16]，因此本研究將羊水干細(xì)胞擬胚體與耳蝸基底膜片段組織共培養(yǎng)，目的在于探討耳蝸基底膜片段組織中的毛細(xì)胞為神經(jīng)元分化提供的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，是否會(huì)誘導(dǎo)羊水干細(xì)胞分化為聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元。本研究結(jié)果說(shuō)明羊水干細(xì)胞分化為聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元，并不依靠基底膜細(xì)胞或是其中的毛細(xì)胞提供的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。羊水干細(xì)胞擬胚體與內(nèi)耳基底膜片段組織形成的二維培養(yǎng)，因?yàn)槿狈?xì)胞間支持接觸的過(guò)程，所以羊水干細(xì)胞擬胚體無(wú)法定向分化為聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元。

基底膜來(lái)源的內(nèi)耳干細(xì)胞空心球體制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞，表達(dá)內(nèi)耳支持細(xì)胞標(biāo)志物P27kip1，在體外能定向誘導(dǎo)羊水干細(xì)胞分化為功能性聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元。內(nèi)耳支持細(xì)胞在體外能促使羊水干細(xì)胞定向分化，可能是通過(guò)Wnt∕β-catenin信號(hào)通路。羊水干細(xì)胞與基底膜來(lái)源的內(nèi)耳支持細(xì)胞制備的飼養(yǎng)層，在三維培養(yǎng)模式中，添加抑制劑Dkk1，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)突起的數(shù)量急劇減少，只有大約21±2.5%的羊水干細(xì)胞分化為形態(tài)典型的神經(jīng)元；而不添加Wnt∕β-catenin 信號(hào)通路抑制劑 Dkk1，可觀察到37±3.0%的羊水干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，且具有典型的神經(jīng)元形態(tài)特征(P＜0.01,One-way ANOVA)；阻斷Wnt信號(hào)除了導(dǎo)致神經(jīng)突起數(shù)量的顯著減少外，神經(jīng)突起的長(zhǎng)度也明顯變短(P＜0.01)，說(shuō)明可能是基底膜來(lái)源的內(nèi)耳支持細(xì)胞提供的Wnt信號(hào)參與調(diào)控羊水干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化[13]。這個(gè)定向分化體系，依賴基底膜來(lái)源的內(nèi)耳支持細(xì)胞對(duì)羊水干細(xì)胞的支持接觸；內(nèi)耳支持細(xì)胞可以作為一種新的神經(jīng)再生支架。這些體外研究數(shù)據(jù)結(jié)果，有助于將羊水干細(xì)胞基礎(chǔ)研究向臨床治療方面轉(zhuǎn)化。

干細(xì)胞體外分化為神經(jīng)細(xì)胞用于神經(jīng)性耳聾的細(xì)胞替代治療的前景已引起關(guān)注[19-21]，羊水干細(xì)胞耳蝸內(nèi)移植的替代治療，具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值及可行性。羊水干細(xì)胞移植豚鼠耳蝸，基底膜是完整且未經(jīng)處理的，而移植的羊水干細(xì)胞要想成功分化為神經(jīng)元，需要解決以下這些實(shí)際問(wèn)題：將羊水干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)鼠耳蝸，怎樣使植入的干細(xì)胞更多的向蝸管內(nèi)遷移，這是首要的問(wèn)題；羊水干細(xì)胞與基底膜上的內(nèi)耳支持細(xì)胞形成緊密的支持接觸，還是懸浮于淋巴液中，是影響結(jié)局的關(guān)鍵；羊水干細(xì)胞定向的遷移至基底膜上的內(nèi)耳支持細(xì)胞表面，并有緊密的接觸，才可能啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，定向分化為功能性神經(jīng)元；基底膜來(lái)源的內(nèi)耳支持細(xì)胞飼養(yǎng)層引發(fā)了Wnt信號(hào)細(xì)胞表面感受器及信號(hào)靶點(diǎn)，導(dǎo)致了級(jí)聯(lián)放大，引起了一些相關(guān)基因的活躍，產(chǎn)生出大量的神經(jīng)元，因此在羊水干細(xì)胞移植運(yùn)用于臨床的過(guò)程中，過(guò)表達(dá)Wnt-1可能有利于羊水干細(xì)胞移植分化效率，這些都有待后續(xù)進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。畢竟內(nèi)耳環(huán)境，比如酸堿度濃度，離子類型和濃度等是否會(huì)對(duì)羊水干細(xì)胞的體內(nèi)神經(jīng)元分化造成影響，還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考量。