江建霞，張俊英，李延莉，蔣美艷，王偉榮，周熙榮，楊立勇，孫超才

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，上海201403)

油菜是我國食用植物油的主要來源之一。2015年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《中國農(nóng)業(yè)展望報告(2015—2024)》指出：我國食用植物油消費(fèi)中，豆油、菜籽油、棕櫚油和花生油分別約占44%、24%、16%和8%，預(yù)計2024年菜籽油消費(fèi)所占比重將為25%。菜籽油不僅是人類重要的食用油，而且在工業(yè)中也有廣泛應(yīng)用，如作為原料制備潤滑劑、生物柴油等，此外，菜籽餅富含蛋白質(zhì)和氨基酸，是牲畜家禽飼料中的優(yōu)質(zhì)蛋白飼源。近幾十年來，改良菜籽油的品質(zhì)是科學(xué)家的主要育種目標(biāo)。隨著基因組測序和分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)技術(shù)的不斷發(fā)展，油菜的油酸、亞油酸、亞麻酸、芥酸和硫苷等重要品質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記和QTL定位的研究成果越來越多。本文重點(diǎn)闡述近些年來利用分子標(biāo)記技術(shù)對油菜的含油量以及油酸、亞麻酸、芥酸和硫苷等性狀進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位和分子標(biāo)記輔助育種的研究現(xiàn)狀。

1 油菜高含油量的QTL定位和連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)

目前，大田推廣種植的大部分商業(yè)種油菜的含油量在40%—50%，距理論含油量還有一定距離，而油菜籽的含油量是決定油菜經(jīng)濟(jì)價值的主要因素，油菜含油量每提高1%相當(dāng)于產(chǎn)量提高2.3%—2.5%，因此，提高油菜含油量是育種學(xué)家的重要育種目標(biāo)[1]。

前人對油菜含油量進(jìn)行了較多的研究，利用雜種優(yōu)勢提高甘藍(lán)型油菜含油量是其中一個重要途徑。Zhao等[2]利用德國品種‘Sollux’和中國品種‘Gaoyou’的雜交F1代培育的DH群體進(jìn)行種子含油量相關(guān)QTLs定位，共獲得6個QTL位點(diǎn)和9個上位效應(yīng)位點(diǎn)，它們對種子含油量及蛋白含量具有多效性，進(jìn)一步鑒定獲得2個獨(dú)立控制含油量而不影響蛋白含量的QTL位點(diǎn)。張寧[3]以歐洲雙低油菜冬性品種‘Tapidor’和中國雙高油菜半冬性栽培種‘Ningyou7’為親本構(gòu)建了TN DH系作圖群體，通過對群體進(jìn)行基因型和表型分析，繪制遺傳圖譜并在C2連鎖群上發(fā)現(xiàn)了一個含油量QTL簇qcO.C2，并初步預(yù)測qcO.C2區(qū)間存在9個與油脂合成相關(guān)的候選基因。郭世星[4]利用加拿大引進(jìn)品系CG38和人工合成甘藍(lán)型油菜品系B25的雜交后代BC1為作圖群體，采用SSR、RAPD和SRAP標(biāo)記構(gòu)建了一張包含20個連鎖群的甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖譜，并檢測到2個含油量相關(guān)QTL位點(diǎn)，它們位于第10連鎖群上的標(biāo)記SSRRa2-EO和EM15ME14之間和第15連鎖群上的標(biāo)記EM5MEllb和EM12ME14間，分別解釋4.43%和18.68%的表型變異。Wang等[5]將低含油量品種‘KenC-8’和高含油量品種‘N53-2’進(jìn)行雜交產(chǎn)生F1，并通過F1代產(chǎn)生的DH系構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，該DH群體被種植在8個自然環(huán)境中，通過含油量性狀的表型分析和QTL定位，最終63個QTLs被鑒定得到，它們被進(jìn)一步整合為24個一致性QTLs，其中5個QTLs來自于低含油量親本‘KenC-8’，19個QTLs來自于高含油量親本‘N53-2’。Teh等[6]利用兩個冬性的雙低油菜品種‘Sansibar’和‘Oase’的雜交F1代獲得的DH系進(jìn)行脂肪酸組成、蛋白含量和含油量等性狀的QTL定位，最終得到含油量相關(guān)的5個微效QTL，命名為DE-Oil.1—DE-Oil.5，分別位于A01、A02、A07、C03-II、C08連鎖群上，且分別解釋了4.3%—6.7%的表型變異，共解釋了27.5%的表型變異。對含油量相關(guān)微效QTL進(jìn)行候選基因的預(yù)測，獲得A01上的候選基因LPAAT(Bra037553)。Sun等[7]利用含油量約50%的高含油量品種‘zy036’和含油量約36%的低含油量品種‘51070’雜交獲得F1代進(jìn)而獲得DH系，構(gòu)建遺傳連鎖圖，共包含527個分子標(biāo)記。結(jié)合多年多點(diǎn)的田間數(shù)據(jù)，一共鑒定得到12個含油量性狀相關(guān)的QTLs，其中9個高含油量的QTLs來自于高含油量品種‘zy036’。4個與種子含油量相關(guān)的候選基因(BnG44、BnG30、BnG40、BnG36)緊密連鎖的標(biāo)記分別為GSNP39、GSSR161、GIFLP106和GIFLP046。Raboanatahiry等[8]通過將多個群體的QTL圖譜進(jìn)行整合，對控制種子含油量和脂肪酸含量的基因和位點(diǎn)分布進(jìn)行同線性分析，最后從57個重疊QTLs區(qū)間中鑒定得到61個與含油量有關(guān)的候選基因，通過網(wǎng)絡(luò)互作和通路分析，KASI、KASII、LPAAT、GPAT等基因與其它基因互作程度最高，它們可能影響種子含油量。

2 與油菜高油酸低亞麻酸相關(guān)的分子標(biāo)記

油菜中油酸和亞麻酸的含量對食用品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)、存儲等方面有著重要的影響。首先，從食用品質(zhì)方面考慮，高油酸含量的菜籽油中多不飽和脂肪酸含量相對較低，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，能夠滿足如煎炸、糕點(diǎn)等食品加工行業(yè)的需要；其次，從營養(yǎng)品質(zhì)方面考慮，菜籽油中油酸(C18∶1)等單不飽和脂肪酸更有益人體健康，而亞麻酸(C18∶3)含有三個不飽和鍵，極易氧化形成自由基，出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[9]，另一方面，α-亞麻酸(ALA)是EPA和DHA等的合成前體，而DHA和EPA對視網(wǎng)膜和神經(jīng)發(fā)育以及免疫炎癥反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用[10-11]；最后，從儲存方面考慮，高油酸菜籽油在純化加熱過程中不容易被氧化，熱穩(wěn)定性好，而亞麻酸在高溫或強(qiáng)光照條件下容易被氧化導(dǎo)致油脂變質(zhì)，不利于儲存。因此，綜合考慮菜籽油中油酸和亞麻酸含量對人體健康和儲存方面的影響，提高菜籽油中油酸含量，降低亞麻酸含量成為油菜品質(zhì)育種中一個重要育種目標(biāo)。

油菜種子中油酸和亞麻酸含量相關(guān)的分子標(biāo)記的開發(fā)和利用尤為重要。Hu等[12]在一個甘藍(lán)型油菜的DH群體中定位得到2個油酸含量有關(guān)的QTL位點(diǎn)，包括位于N5連鎖群上的一個主效QTL位點(diǎn)(fad2基因)和位于N1連鎖群上的一個微效QTL位點(diǎn)。同時，他們還定位得到2個亞麻酸含量有關(guān)的QTL位點(diǎn)，其中主效QTL被證實(shí)為N14連鎖群上的fad3c基因，另一個主效QTL是N4連鎖群上的fad3a基因。將EMS突變體與野生型品種中fad2和fad3c基因序列比較，發(fā)現(xiàn)兩基因均發(fā)生單核苷酸突變，進(jìn)而引起脂肪酸含量變化，根據(jù)突變體和野生型間fad2和fad3c的序列差異，設(shè)計的2個SNP標(biāo)記在甘藍(lán)型油菜高油酸低亞麻酸輔助選擇育種中發(fā)揮重要作用。Javidfar等[13]獲得了8個與油酸和亞麻酸含量相關(guān)聯(lián)的RAPD標(biāo)記，其中標(biāo)記UBC2830擴(kuò)增片段對油酸含量表型貢獻(xiàn)率為43%，對亞麻酸含量表型變異的貢獻(xiàn)率為13%，它在被變換成SCAR標(biāo)記后可用于高油酸和低亞麻酸育種的標(biāo)記輔助選擇。張潔夫等[14]利用含油量較低的低芥酸甘藍(lán)型油菜品系A(chǔ)PL01(含油量37.03%，芥酸含量0.33%)和含油量較高的高芥酸抗菌核病品種‘M083’(含油量43.28%，芥酸含量42.65%)的回交群體，獲得了兩個與油酸含量相關(guān)的主效QTLs，它們分別位于N8連鎖群的m11e37b—A0226Ba267和N13連鎖群的m18e46—m20e25a，解釋11.73%和27.14%的表型變異。欽潔[15]利用低芥酸低硫苷冬性品種‘甲A177’與高油酸低亞麻酸的歐洲春油菜‘甲A254’雜交獲得F1代，并進(jìn)一步獲得DH系，在DH群體中檢測到位于N5連鎖群上的1個油酸主效QTL，它解釋了84.6%的遺傳變異，另外還檢測到2個定位在N4和N14連鎖群上的亞麻酸主效QTL，分別解釋了59.0%和23.5%的遺傳變異。陳偉[16]在低芥酸低硫苷冬性品種‘甲A177’與高油酸低亞麻酸的歐洲春油菜‘甲A254’的雜交組合中，利用BSA法篩選得到一個控制油酸含量的主效QTL，位于SSR標(biāo)記SSR373和BRGMS630之間，它對油酸含量的貢獻(xiàn)率為85.61%，利用兩個標(biāo)記一起進(jìn)行油酸含量性狀的前景選擇，獲得高油酸含量單株的正確率為94.12%；篩選得到兩個控制亞麻酸含量的QTLs，分別解釋了26.37%和25.18%的表型變異，由此推測亞麻酸含量性狀可能受多個基因共同控制，篩選獲得相關(guān)的分子標(biāo)記有BM135、SSR698、BM44-2和SSR128-3。楊燕宇[17]利用無芥酸高油酸親本‘HOP’和無芥酸低油酸親本‘湘油15’雜交獲得的F2代分離群體，用SSR標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，發(fā)現(xiàn)了2個油酸含量相關(guān)的QTLs，分別位于A5和C5連鎖群上，它們分別解釋59%和16%的表型變異，其中位于A5連鎖群的QTL與FAD2基因有關(guān)。位于兩個QTL峰值上的標(biāo)記為BrG23Y12和BrP06Y06，它們分別對應(yīng)白菜A5染色體上的KBrB063G23和KBrB087P06這2個BACs。楊慶勇[18]在鑒定出甘藍(lán)型油菜中所有FAD2和FAD3基因的基礎(chǔ)上，試圖找到歐洲春油菜品系SW Hickory(油酸含量約為78%，亞麻酸含量小于3%)與普通雙低冬油菜品系 JA177(油酸含量為64%，亞麻酸含量為8%)材料之間的FAD2基因差異，結(jié)果表明高油酸親本SW Hickory中FAD2.a基因在第567和第568堿基對之間有一個4 bp的插入，該插入導(dǎo)致移碼突變，終止密碼子提前出現(xiàn)，據(jù)此開發(fā)了一個SCAR標(biāo)記，可對油酸含量進(jìn)行前景選擇，同時，根據(jù)FAD3基因在親本SW Hickory和JA177之間的單核苷酸差異，設(shè)計SNP標(biāo)記用于低亞麻酸的分子標(biāo)記輔助選擇。

3 甘藍(lán)型油菜芥酸含量的遺傳與QTL定位

芥酸是十字花科植物種子油脂中含量較高的脂肪酸之一，具有較長的碳鏈，在人體內(nèi)不容易消化吸收，對于食用菜籽油而言，無芥酸或低芥酸含量(小于3%)是判斷菜籽油是否健康的一個重要指標(biāo)，對于工業(yè)用菜籽油而言，高芥酸含量的菜籽油具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。大量研究結(jié)果表明芥酸含量由A8和C3染色體上的2個主要的QTLs調(diào)控，另外，也受一些微效QTL的影響[19-22，23]。甘藍(lán)型油菜中的BnaA08g11130D和BnaC03g65980D基因被證實(shí)是控制芥酸含量的2個主要基因，它們是擬南芥中控制芥酸含量基因FAE1的同源基因[24-29]。張潔夫等[30]用低含油量低芥酸的甘藍(lán)型油菜‘APL01’與高含油量高芥酸品種‘M083’雜交獲得F1，將F1與親本‘APL01’回交得到的BC1F1為作圖群體繪制遺傳圖譜，通過QTL掃描獲得2個芥酸含量相關(guān)的QTL，分別為qER8和qER13，其中qER8位于N8連鎖群的m11e37b和A0226Ba267標(biāo)記之間，對芥酸含量的貢獻(xiàn)率為16.74%；qER13位于N13連鎖群的A0301Bb398和m18e46標(biāo)記間，對芥酸含量的貢獻(xiàn)率為31.32%。qER8和qER13兩側(cè)的4個標(biāo)記m11e37b、A0226Ba267、A0301Bb398和m18e46可用于油菜低芥酸育種過程中。林兵等[31]在甘藍(lán)型油菜A8連鎖群上共檢測到了14個芥酸含量相關(guān)QTLs，它們被整合成2個同義QTL，即qEA.A8.1和qEA.A8.2，其中qEA.A8.1是新發(fā)現(xiàn)的對種子芥酸含量具有顯著性作用的位點(diǎn)，而qEA.A8.2對應(yīng)的候選基因是FAE-1。湯天澤[32]認(rèn)為特高芥酸性狀主要受2對具有加性-顯性-上位性效應(yīng)的主基因控制，同時受到多基因控制，以主基因效應(yīng)為主，并獲得CB10364和BRMS-017這2個SSR標(biāo)記，它們與芥酸含量緊密連鎖，在單株中同時出現(xiàn)時菜籽油中芥酸含量>57%，能較好地檢測出特高芥酸單株。

4 甘藍(lán)型油菜中硫代葡萄糖苷含量的分子標(biāo)記和QTL定位

4.1 硫苷的化學(xué)性質(zhì)及生物活性

硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)是植物體內(nèi)合成的一種含氮次級代謝產(chǎn)物，根據(jù)側(cè)鏈基團(tuán)的不同，硫苷可分為脂肪族、芳香族和吲哚族三大類，至今已分離得到120多種硫苷[33]。以十字花科植物如擬南芥、花椰菜和青花菜中硫苷含量最高[34]，且種子中的含量最為豐富。硫苷經(jīng)由芥子酶水解后產(chǎn)生異硫氰酸酯、硫氰酸酯和腈等有生物活性的水解產(chǎn)物。早些年來，大田種植的油菜品種產(chǎn)生的菜籽油和菜籽餅中含有比較高濃度的硫苷，會對人體健康造成不利影響，畜禽等食用菜籽餅飼料后可能會引起臟器功能異?；虺霈F(xiàn)中毒等癥狀，限制了菜籽餅作為蛋白飼料的應(yīng)用方式[35]。但是，近些年來，育種學(xué)家和科學(xué)家為了降低菜籽油中硫苷和芥酸含量做了大量研究和努力，育成了大批具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的雙低油菜品種。

4.2 硫苷的遺傳

油菜基因組中存在3個控制硫苷含量的主效QTLs，分別位于染色體A9、C2和C9上[20,22，36-37]，與擬南芥MYB28基因同源的序列有3個，這3個同源序列分別位于控制硫苷含量的3個主效QTLs區(qū)間內(nèi)，它們被認(rèn)為是控制硫苷含量變異的候選基因[20,29，37]。MYB28是控制脂肪族硫苷合成的一個轉(zhuǎn)錄因子[38]。Wang等[39]利用GWAS結(jié)合高通量基因組重測序以及表型分析方法檢測甘藍(lán)型油菜種子含油量、芥酸和硫苷含量的多態(tài)性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)染色體A9、C2和C9上，調(diào)控硫苷含量的3個主效QTLs位點(diǎn)都存在MYB28基因，這進(jìn)一步證實(shí)了MYB28基因可調(diào)控油菜籽中硫苷含量。Qu等[22]利用60K油菜SNP芯片對油菜籽中硫苷含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)作圖，發(fā)現(xiàn)11個與硫苷含量相關(guān)的SNP峰值，它們分別位于基因組A8、A9、C3和C9上，其中BnGRT2和BnMYB28基因被證實(shí)與硫苷含量相關(guān)。Marschalek等[40]發(fā)現(xiàn)控制甘藍(lán)型油菜中硫苷含量的6個QTLs中，有3個QTLs起主效作用，分別位于連鎖群9、16和18上，有3個QTLs的作用較小，分別位于連鎖群2、3和6上。Lionneton等[41]發(fā)現(xiàn)4個控制丙烯基硫苷的QTLs和2個控制3-丁烯基硫苷合成的QTLs，并且有2個控制丙烯基硫苷合成的QTLs與控制3-丁烯基硫苷合成的2個QTLs相互連鎖。Ripley等[42]發(fā)現(xiàn)，控制3-丁烯基硫苷合成的基因位于連鎖群2和11上，而控制丙烯基硫苷合成的基因位于連鎖群2和8上。

5 問題與展望

通過對油菜含油量及品質(zhì)性狀相關(guān)分子標(biāo)記和QTL定位的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，將前人的研究結(jié)果進(jìn)行比較，歸納得到以下幾點(diǎn)結(jié)果：(1)控制種子含油量的QTL位點(diǎn)非常多，目前被報道的含油量性狀相關(guān)QTLs多達(dá)24個，已鑒定含油量相關(guān)的候選基因包括LPAAT(Bra037553)[6]、BnG27、BnG28、BnG30、BnG32、BnG36、BnG40、BnG44[7]、KASI、KASII、LPAAT、GPAT[8]等；(2)控制油酸含量的主效基因有N5連鎖群上的fad2基因，對應(yīng)于白菜A5染色體上的KBrB063G23這個BAC，另外，N8、N13和N15等連鎖群上可能存在相關(guān)主效QTLs[12，15,17-18]；(3)可能存在2個控制亞麻酸含量的主效QTLs，分別為定位在N4連鎖群上的fad3a和N14連鎖群上的fad3c[12，15，18]；(4)甘藍(lán)型油菜中與擬南芥FAE1同源的兩個基因BnaA08g11130D和BnaC03g65980D被證實(shí)是控制芥酸含量的主效基因，另外，N6和N12、N7和N15、N8和N13等連鎖群上可能也存在控制芥酸含量相關(guān)QTLs，其中位于N8連鎖群的m11e37b和A0226Ba267標(biāo)記間的qER8 對芥酸含量貢獻(xiàn)率為16.74%，位于N13連鎖群的A0301Bb398和m18e46標(biāo)記間的qER13對芥酸含量的貢獻(xiàn)率為31.32%。qER8和qER13兩側(cè)的4個標(biāo)記可應(yīng)用于油菜低芥酸育種過程中，另外，N8連鎖群上的CB10364和BRMS-017這2個SSR分子標(biāo)記與芥酸含量緊密連鎖，在單株中同時出現(xiàn)時，芥酸含量>57%，能很好地應(yīng)用于特高芥酸單株的檢測中[24-26]；(5)油菜基因組中存在3個控制硫苷含量的主效QTLs，它們分別位于染色體A9、C2和C9上，這3個主效QTLs上的候選基因可能是擬南芥MYB28基因在油菜中對應(yīng)的3個同源基因，另外，BnGRT2基因也被證實(shí)參與硫苷含量的調(diào)控，這些研究結(jié)果被高通量測序和SNP芯片結(jié)果證實(shí)[40-42]。目前，通過SSR和AFLP等分子標(biāo)記方法對甘藍(lán)型油菜中的性狀相關(guān)基因進(jìn)行QTL定位和進(jìn)一步的候選基因篩選仍存在一些困難：首先，控制油菜含油量以及品質(zhì)性狀的微效基因非常多，這些基因通過顯性效應(yīng)、加性效應(yīng)、上位性效應(yīng)以及基因與環(huán)境的互作效應(yīng)形成一個非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，只有將多個QTL位點(diǎn)或基因進(jìn)行有效聚合才能較大程度提高種子含油量和改良菜籽油品質(zhì)；第二，由于甘藍(lán)型油菜是異源四倍體，基因組較大且重復(fù)序列多，而控制性狀的基因多數(shù)都是數(shù)量性狀基因，因而對這些基因進(jìn)行QTL定位時常會得到多個QTL位點(diǎn)，主效基因或微效基因分布在多個連鎖群中，篩選候選基因的范圍擴(kuò)大，需要開發(fā)大量的新的分子標(biāo)記才能獲得高密度遺傳圖譜進(jìn)而進(jìn)行QTL定位或候選基因篩選，工作量很大。

分子標(biāo)記輔助選擇(Marker Assisted Selection，MAS)是直接依據(jù)個體基因型進(jìn)行選擇，克服了傳統(tǒng)育種中通過表現(xiàn)型間接對基因型進(jìn)行選擇造成的周期長、效率低、準(zhǔn)確率低的缺點(diǎn)，可節(jié)約育種時間，提高育種效率。雖然近幾年來大量QTLs和分子標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)和開發(fā)，但是應(yīng)用到育種和生產(chǎn)實(shí)際中的分子標(biāo)記相對較少。陳偉等[16]利用篩選的油酸主效QTLs兩側(cè)的SSR標(biāo)記(BRMS007和BRGMS630)，以及與亞麻酸含量相關(guān)的4個SSR標(biāo)記(sN2025、BoGMS798、Nal2-D09和0110-D03)進(jìn)行甘藍(lán)型油菜高油酸和低亞麻酸植株的選育，最終在BC2F2和BC3F2代獲得高油酸和低亞麻酸單株；劉梓諭等[43]篩選得到一個EST標(biāo)記OC2-1，與含油量性狀關(guān)聯(lián)達(dá)極顯著水平，可在MAS中直接使用；Javidfar等[13]一共獲得了8個RAPD標(biāo)記，它們與油酸和亞麻酸含量相關(guān)聯(lián)，其中標(biāo)記UBC2830擴(kuò)增片段對油酸和亞麻酸含量貢獻(xiàn)率分別為43%和13%，它在被變換成SCAR標(biāo)記后可用于高油酸和低亞麻酸育種的標(biāo)記輔助選擇；湯天澤[32]圍繞油菜籽的特高芥酸含量性狀展開了一系列遺傳研究，獲得CB10364和BRMS-017這2個SSR標(biāo)記，它們與芥酸含量緊密連鎖，能較好檢測特高芥酸單株，可用于分子標(biāo)記輔助選擇。近幾年來，隨著白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜基因組測序完成并且序列注釋的逐漸完善，尋找和開發(fā)分子標(biāo)記的工作變得更加便利，開發(fā)更多的SSR、AFLP等分子標(biāo)記將有利于更高密度的遺傳圖譜的繪制、QTL的精細(xì)定位及候選基因的篩選。分子標(biāo)記輔助育種作為油菜育種的重要途徑，可進(jìn)一步進(jìn)行高效育種，獲得更多更好的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗油菜品種。