韓樂 許彪

作者單位：650500 昆明 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科

骨肉瘤（osteosarcoma）亦稱成骨源性肉瘤，是兒童和青少年常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一［1］，具有較高的局部浸潤(rùn)性和早期系統(tǒng)性轉(zhuǎn)移傾向。骨肉瘤一般呈進(jìn)行性膨脹生長(zhǎng)，影像學(xué)檢查可見不同程度、不同性質(zhì)的骨質(zhì)破壞，傳統(tǒng)手術(shù)治療5年生存率為20%左右，預(yù)后較差［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤細(xì)胞分裂間期細(xì)胞質(zhì)微管結(jié)構(gòu)破壞、微管組裝缺陷，與正常細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)微管變化差異明顯［4］，與骨肉瘤細(xì)胞分裂增殖和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。微管靶向制劑是一類通過促進(jìn)或抑制微管蛋白聚合而干擾腫瘤細(xì)胞有絲分裂和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的靶向藥物，藥效高、毒性低［5］。目前，微管靶向制劑作為一種微管干擾藥物已廣泛用于骨肉瘤治療，且已取得肯定的成效。本文對(duì)微管及其靶向制劑與骨肉瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究進(jìn)展作一綜述。

1 微管概述

微管分布于所有真核生物中，直徑為22～25 nm，內(nèi)徑為10～15 nm，管壁厚度約為5 nm，是由α和β微管蛋白異二聚體構(gòu)建而成的不分支中空纖維管狀結(jié)構(gòu)［6］，可組配成單微管（常見于細(xì)胞質(zhì)和神經(jīng)元）、二聯(lián)微管（常見于纖毛和鞭毛）和三聯(lián)微管（常見于基體和中心粒），其中分散于細(xì)胞質(zhì)中的微管可作為細(xì)胞骨架系統(tǒng)成分。微管在細(xì)胞中呈網(wǎng)狀或束狀分布，且可與其他蛋白共同組裝成基粒、紡錘體、鞭毛、纖毛、軸突等結(jié)構(gòu)。α微管蛋白和β微管蛋白是高度保守的真核蛋白質(zhì)，也是微管裝配的基本亞基單位，二者裝配形成的二聚體上具有一個(gè)秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)長(zhǎng)春花堿結(jié)合位點(diǎn)，可專一性地與秋水仙堿及長(zhǎng)春花堿等微管靶向制劑結(jié)合，發(fā)揮干擾細(xì)胞分裂的作用［7］。微管的生物結(jié)構(gòu)、空間排列和動(dòng)態(tài)變化均受微管相關(guān)蛋白調(diào)控［8］。微管并非一成不變，微管末端可通過α/β-tubulin異二聚體的摻入和去除完成持續(xù)的生長(zhǎng)和解聚過程，在細(xì)胞有絲分裂中可從相對(duì)穩(wěn)定的界面排列轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨葎?dòng)態(tài)的雙極紡錘體。此外，微管還可經(jīng)生長(zhǎng)、收縮和靜息三個(gè)階段組裝成束狀細(xì)絲排列，每個(gè)階段中的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞分裂周期S期（DNA合成期）和G2期（DNA合成后期）過程中微管蛋白的大量合成具有重要意義［9-10］。有研究發(fā)現(xiàn)微管及其相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)變化為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)提供了主要?jiǎng)恿Γ羌?xì)胞質(zhì)——細(xì)胞核運(yùn)輸微管所必需的［11］。研究表明，微管與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的相互作用可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)稱性破壞，使細(xì)胞極化而發(fā)生分裂、形態(tài)改變和遷移，對(duì)驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有重要意義［12］。此外，微管作為一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，可使腫瘤細(xì)胞周期阻滯于細(xì)胞分裂期并誘導(dǎo)其凋亡，是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)［13］。

2 微管與骨肉瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一種基因編程的能量依賴性細(xì)胞死亡過程。細(xì)胞凋亡期間細(xì)胞骨架積極參與垂死細(xì)胞的特征性形態(tài)重排，而微管與中間絲在細(xì)胞凋亡的早期階段被解聚［14］，解聚后的微管蛋白經(jīng)重組裝可形成紡錘體從而介導(dǎo)染色體運(yùn)動(dòng)。染色體分離需在著絲粒上組裝動(dòng)粒以介導(dǎo)與紡錘體微管的相互作用并控制細(xì)胞周期進(jìn)展。SONG等［15］認(rèn)為微管和微管蛋白的翻譯后修飾可導(dǎo)致微管多樣性并影響微管的裝配動(dòng)力學(xué)，從而影響細(xì)胞周期。微管具有高度復(fù)雜的不穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)行為，即在一定體外培養(yǎng)條件下，α、β微管蛋白二聚體的濃度必須在臨界濃度以上二聚體才能聚合為微管，當(dāng)濃度低于臨界濃度時(shí)，微管即解聚為二聚體，且單一微管一直處于增長(zhǎng)和縮短兩個(gè)階段［16］。細(xì)胞微管動(dòng)力學(xué)的上述顯著變化表征了細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段中微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定現(xiàn)象。微管在細(xì)胞分裂前期形成紡錘體進(jìn)而牽引染色體向細(xì)胞兩極移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞分裂完成后微管最終形成膜結(jié)合外凋亡小體被吞噬降解［17］。研究表明，組成微管的微管蛋白是多種小分子天然化合物的靶標(biāo)，促進(jìn)或抑制微管蛋白解聚均可能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡［18］。骨肉瘤細(xì)胞與正常成骨細(xì)胞相比具有更高含量的微管纖維，而微管纖維與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，微管誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞活力降低可能通過激活原癌基因Bcl-2磷酸化，使抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少而細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，致使Bax與Bcl-2比值升高而進(jìn)一步引起線粒體細(xì)胞色素C釋放和激活caspase-9/-3依賴的凋亡途徑，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞大量阻滯于G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，而下調(diào)微管和微管蛋白表達(dá)則可阻礙骨肉瘤細(xì)胞的有絲分裂并使其凋亡［19］。由此可見，微管在骨肉瘤細(xì)胞的線粒體凋亡途徑中發(fā)揮重要作用，但其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3 微管靶向制劑與骨肉瘤治療

美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）骨腫瘤臨床實(shí)踐指南指出，目前國(guó)際上公認(rèn)的骨肉瘤有效的治療方法主要是原發(fā)灶擴(kuò)大手術(shù)切除及術(shù)后輔助化療。但多年以來(lái)傳統(tǒng)化療藥物的療效并未提升，且骨肉瘤尚無(wú)理想的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)分子標(biāo)志物［20］。微管作為真核細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白直接參與了腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，其靶向制劑可通過抑制微管聚合（促解聚）或抑制微管解聚（促聚合）作用于微管蛋白，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。根據(jù)作用機(jī)制的不同，微管靶向制劑可分為微管蛋白解聚劑（如秋水堿類、長(zhǎng)春堿類）和微管蛋白聚合劑（如紫杉醇類）。目前應(yīng)用于骨肉瘤的新型輔助化療的微管靶向制劑主要為秋水堿類、長(zhǎng)春堿類和紫杉醇類。

3.1 微管蛋白解聚劑

微管蛋白解聚劑是一種抑制微管聚合的微管蛋白活性抑制劑，主要包括秋水仙堿及其相關(guān)化合物（如角秋水仙堿、異秋水仙堿類似物）和長(zhǎng)春花堿及其類似物（如長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱等）。研究表明秋水仙堿、長(zhǎng)春花堿等微管抑制劑可分別作用于秋水仙堿位點(diǎn)和長(zhǎng)春堿位點(diǎn)［21］，從而干擾細(xì)胞分裂。

3.1.1 秋水仙堿 秋水仙堿是從百合科植物秋水仙中提取的一種天然化合物，可與微管相互作用并破壞紡錘體抗有絲分裂活性，從而阻止細(xì)胞生長(zhǎng)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，人骨肉瘤細(xì)胞系MG63暴露于至少一個(gè)細(xì)胞周期的秋水仙堿后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，且細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bcl-X（L）的表達(dá)亦升高［22］，說明秋水仙堿能夠誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡從而使其生長(zhǎng)停滯。另有研究［23］發(fā)現(xiàn)秋水仙堿介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡微管網(wǎng)絡(luò)重組可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加和繼發(fā)性壞死，微管細(xì)胞骨架的重構(gòu)在維持細(xì)胞凋亡過程中的質(zhì)膜完整性發(fā)揮重要作用。秋水仙堿作為一種高效微管靶向藥物，能阻斷細(xì)胞周期于G2/M期并誘發(fā)細(xì)胞凋亡，抑制微管形成而發(fā)揮抗細(xì)胞增殖作用，可作為開發(fā)潛在腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物［24］。然而秋水仙堿在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)亦可對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性，可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生如嘔吐、腹瀉、肝功能異常、腎臟損害、骨髓抑制等較嚴(yán)重的毒副反應(yīng)［25］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤聯(lián)合可以強(qiáng)烈阻礙紡錘體形成并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常成纖維細(xì)胞的毒性顯著降低［26］。另有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥或小劑量應(yīng)用可明顯降低秋水仙堿毒副反應(yīng)［27］，因此秋水仙堿仍具有十分廣闊的臨床應(yīng)用前景。

3.1.2 ABT-751 微管是骨肉瘤治療中最有吸引力和有效的靶標(biāo)之一，然而影響微管動(dòng)態(tài)藥物因其化學(xué)抗性和毒性在臨床應(yīng)用中受限，因此開發(fā)靶向微管的新型試劑尤為必要。ABT-751是秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)的新型抗有絲分裂劑，也是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有抗有絲分裂活性的磺胺類藥物，可通過抑制微管蛋白聚合，破壞骨肉瘤細(xì)胞有絲分裂過程中的紡錘體結(jié)構(gòu)，使DNA損傷、線粒體膜電位崩潰并將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［28-29］。ABT-751的Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，4例兒童骨肉瘤患者口服ABT-751 12周后，腫瘤直徑明顯縮小，ABT-751抗腫瘤細(xì)胞增殖活性作用顯著［30］?？梢夾BT-751在骨肉瘤治療中取得了良好療效，其作為一種新型抗微管蛋白藥物在今后骨肉瘤化療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3.1.3 長(zhǎng)春瑞濱 長(zhǎng)春瑞濱是一種長(zhǎng)春花堿半合成衍生物，可通過干擾微管蛋白的聚合使細(xì)胞在有絲分裂過程中微管形成受阻，從而發(fā)揮廣譜抗腫瘤活性，毒性較低。RONCUZZI等［31］研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春瑞濱在人骨肉瘤細(xì)胞株HOS和MG-63中具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡的作用，且生長(zhǎng)抑制作用呈顯著的劑量和時(shí)間依賴性，其抗腫瘤活性的主要機(jī)制可能是通過抑制紡錘體微管動(dòng)力學(xué)，從而阻斷有絲分裂進(jìn)程而導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞凋亡。說明長(zhǎng)春瑞濱在體外人骨肉瘤中具有抗增殖作用，有望成為新的抗人骨肉瘤化療藥物。

3.2 微管蛋白聚合劑

微管蛋白聚合劑是抑制微管解聚的一類藥物，可通過促進(jìn)微管蛋白聚合形成微管聚合物，阻斷細(xì)胞分裂周期的G2期和M期干擾細(xì)胞分裂而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，主要包括紫杉醇及其類似物。目前以紫杉醇為代表的微管蛋白聚合劑對(duì)骨肉瘤表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。

3.2.1 紫杉醇 紫杉醇是一種從短葉紫杉樹皮中提取的具有抗腫瘤活性的自然產(chǎn)物，通過穩(wěn)定有絲分裂紡錘體的微管介導(dǎo)其活性。紫杉醇作為一種新型抗微管藥物，能特異性地結(jié)合到微管的β位上，使微管聚合成團(tuán)塊和束狀，并通過阻止多聚化過程而使微管蛋白穩(wěn)定地抑制細(xì)胞有絲分裂［32］。有研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)分子機(jī)制不僅是通過聚合β-微管蛋白阻斷有絲分裂階段誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可能通過缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α 途徑誘導(dǎo)自噬［33］。SPINA 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇聯(lián)合無(wú)機(jī)磷酸鹽對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U20S增殖和侵襲的抑制作用顯著；二者聯(lián)合用藥具有協(xié)同效應(yīng)且對(duì)正常組織表現(xiàn)為低毒反應(yīng)。紫杉醇作為微管蛋白聚合劑聯(lián)合無(wú)機(jī)磷酸鹽的抗骨肉瘤作用，為臨床骨肉瘤輔助化療提供了新的途徑，未來(lái)骨肉瘤的聯(lián)合化學(xué)療法將會(huì)受到越來(lái)越多的關(guān)注。

3.2.2 多西紫杉醇 多西紫杉醇是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的紫杉烷類化合物，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與紫杉醇相似，多西紫杉醇的抗腫瘤活性是紫杉醇的1.3～12.0倍，對(duì)微管結(jié)合部位的親和力是紫杉醇的2倍［35］。多西紫杉醇主要作用于構(gòu)成細(xì)胞骨架的微管網(wǎng)絡(luò)，通過促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，阻止其解聚成亞單位，進(jìn)而影響微管聚合與解聚的動(dòng)態(tài)平衡，形成穩(wěn)定的非功能性微管，從而破壞細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［36］。JIN 等［37］研究發(fā)現(xiàn)，多西紫杉醇可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞系HOS 8603的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。此外，陶海等［38］報(bào)道多西紫杉醇聯(lián)合順鉑用藥可使人骨肉瘤細(xì)胞HOS-8603的細(xì)胞凋亡數(shù)大量增加并形成凋亡小體，與單用順鉑時(shí)比較，聯(lián)合用藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)更顯著且隨著兩藥作用時(shí)間延長(zhǎng)而愈加顯著；此外兩者聯(lián)合用藥還可使荷瘤裸鼠腫瘤體積顯著下降，且毒副反應(yīng)未增加?？梢姡辔髯仙即悸?lián)合順鉑用藥對(duì)骨肉瘤化療效果更佳，為骨肉瘤化療提供了新的思路。綜上認(rèn)為，紫杉醇類化合物在骨肉瘤細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

4 小結(jié)

骨肉瘤治療方法主要為手術(shù)結(jié)合化療，但化療耐藥性常導(dǎo)致化療失敗［39］，是骨肉瘤臨床治療面臨的一大難題。目前研究認(rèn)為微管可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，其靶向制劑秋水堿類、長(zhǎng)春堿類和紫杉醇類等已廣泛應(yīng)用于骨肉瘤治療，且取得較好的臨床療效，尤其以紫杉醇為代表的微管蛋白聚合劑在骨肉瘤治療中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。但是微管靶向制劑的毒副作用亦不容小覷，同時(shí)多藥耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移等問題，使其臨床推廣應(yīng)用受到一定限制。因此，進(jìn)一步研發(fā)新型微管靶向制劑，嘗試微管靶向制劑與其他藥物聯(lián)合，有望提高骨肉瘤的治療療效及降低毒副反應(yīng)，增強(qiáng)化療敏感性，這也將是未來(lái)抗骨肉瘤藥物研發(fā)的新的方向。