彭旭紅 李佳 王玉，3 張健 羅偉濠 朱樂攀 胡政 吳海燕 李艷蘭 段麗麗

作者單位：423000 郴州 1郴州市第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)中心；2郴州市第一人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所；065201 廊坊 3燕達(dá)醫(yī)院研究院中心實(shí)驗(yàn)室；423000 郴州 4郴州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心；5郴州市第一人民醫(yī)院病理診斷中心；421001 衡陽 6南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐漸上升趨勢［1］，而甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的病理類型，占TC的85%～90%［2-3］。甲狀腺癌原發(fā)灶的解剖位置位于頸部皮下，有利于超聲引導(dǎo)下穿刺活檢，手術(shù)和131碘治療是主要的治療方法，10年生存率可達(dá)90%以上［4-5］。盡管多數(shù)甲狀腺癌患者預(yù)后較好，但仍有部分患者因轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)死亡［6］。尋找特異性的腫瘤標(biāo)志物對甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的早期診斷、預(yù)后評估和復(fù)發(fā)監(jiān)測均具有重要意義［7-8］。醛酮還原酶1B10（aldo-keto reductase family 1B10，AKR1B10）屬于醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）超家族，研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌［9］、肝癌［10-12］、肺癌［13］、口腔癌［14］等腫瘤組織中高表達(dá)，且與肝癌和乳腺癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，但其與PTC的關(guān)系未見報(bào)道。本研究檢測AKR1B10在PTC中的表達(dá)，并分析其臨床病理特征的關(guān)系，為臨床診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2015年7月于郴州市第一人民醫(yī)院經(jīng)超聲診斷的237例甲狀腺結(jié)節(jié)患者的病理標(biāo)本，其中甲狀腺乳頭狀癌117例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫40例、甲狀腺濾泡性腺瘤40例、橋本甲狀腺炎40例。同時選取本院病理科法醫(yī)尸檢福爾馬林浸泡的甲狀腺正常組織13例作為對照。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療；⑵經(jīng)常規(guī)石蠟病理確診；⑶臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤或治療后復(fù)發(fā)患者。收集患者性別、年齡、發(fā)病部位、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、周圍浸潤情況、腫瘤大小、腫瘤TNM分期等臨床資料。本研究經(jīng)郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2015002），患者知情同意。

1.2 主要材料

AKR1B10抗體為自制兔抗，β-tubublin抗體購于上海碧云天生物有限公司；山羊血清，磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.2～7.4），枸櫞酸抗原修復(fù)液（pH 6.0），濃縮型DAB試劑盒，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司；聚丙烯凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜裝置購于美國Bio-Rad公司。

1.3 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測AKR1B10蛋白的表達(dá)

在超聲引導(dǎo)下或外科手術(shù)中切取甲狀腺癌新鮮組織30例和甲狀腺癌患者正常甲狀腺新鮮組織6例用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。甲狀腺組織剪碎后，加入蛋白裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度；以每個樣品50 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；一抗（孵育的一抗分別為 AKR1B10 和 β-tubulin，稀釋比例 1∶1 000）孵育，4℃冰箱過夜，用PBST洗滌液洗滌3次，每次5 min。加入二抗（按 1∶5 000 稀釋），室溫孵育 2 h，用PBST洗滌液洗滌3次，每次5 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，以β-tubulin作為內(nèi)參，掃描AKR1B10和β-tubulin條帶灰度值，以 AKR1B10/β-tubulin的灰度值表示AKR1B10的表達(dá)水平。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測不同甲狀腺組織中AKR1B10蛋白的表達(dá)

從病理科收集石蠟包埋甲狀腺組織樣本，包括甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺濾泡性腺瘤、橋本甲狀腺炎，采用SP法，連續(xù)4 μm切片，常規(guī)脫蠟、脫水；阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶（3%H2O2孵育后PBS沖洗）；抗原修復(fù)（標(biāo)本置于pH為6.0的枸櫞酸緩沖液中）；血清工作液封閉30 min；滴加AKR1B10抗體，4℃孵育過夜；滴加通用型二抗，置于37℃溫箱孵育1 h；DAB顯色，蘇木素復(fù)染；脫水、干燥、封片。每張切片于高倍鏡（×400）下隨機(jī)選取5個視野，采用染色強(qiáng)度（無色為0分，淡黃色1分，深黃色2分，黃褐色3分）和染色面積（0～5%計(jì)0分，6%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，50%以上計(jì)3分）雙重指標(biāo)綜合判斷陽性表達(dá)情況，兩項(xiàng)指標(biāo)評分相乘，結(jié)果＜2分計(jì)為“-”，2～3分計(jì)為“+”，4～5分計(jì)為“++”，6分以上計(jì)為“+++”［15-16］，++～+++視為 AKR1B10 陽性表達(dá)，-～++為AKR1B10陰性表達(dá)。為降低人為誤差，由2名醫(yī)師分別在鏡下評分，結(jié)果取平均值，評分差異較大的結(jié)果請病理科專家會診。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。AKR1B10在不同甲狀腺組織中的表達(dá)差異比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)小于1時，采用Fisher確切概率法。AKR1B10在甲狀腺正常組織和PTC組織中的差異性表達(dá)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AKR1B10在甲狀腺正常組織和PTC組織中的表達(dá)

采用Western Blot檢測結(jié)果顯示AKR1B10蛋白在PTC組織中的表達(dá)水平高于甲狀腺正常組織（0.82±0.10vs0.22±0.07，t=2.702，P=0.011）。見圖 1。

圖1 AKR1B10在甲狀腺正常組織和PTC組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of AKR1B10 in normal thyroid tissues and PTC tissues

2.2 AKR1B10在甲狀腺癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，AKR1B10在PTC組織中呈高表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，不均勻分布，細(xì)胞染色深淺不一。見圖2。

圖2 PTC組織中AKR1B10的表達(dá)（×400）Fig.2 Evaluation standard of AKR1B10 expression in PTC tissues（×400）

2.3 AKR1B10在不同甲狀腺組織中的表達(dá)

AKR1B10在PTC組織中陽性表達(dá)率最高（79.5%），在橋本甲狀腺炎組織的陽性表達(dá)率次之（75.0%）。PTC組織中AKR1B10陽性表達(dá)率與橋本甲狀腺炎組織的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.346，P＞0.05），但與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織、甲狀腺濾泡性腺瘤組織、PTC癌旁組織、甲狀腺正常組織比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 AKR1B10在PTC癌組織和甲狀腺良性組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of AKR1B10 in PTC and in benign lesions of thyroid tissues

2.4 AKR1B10表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系

共收集106例PTC患者完整的臨床病理資料，其中94例可準(zhǔn)確分期，AKR1B10表達(dá)與癌組織周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（χ2=8.059，P=0.007），男性患者 AKR1B10的陽性表達(dá)率高于女性（91.0%vs60.7%，χ2=8.509，P=0.010）。見表 2。

3 討論

近年來，甲狀腺癌發(fā)病率持續(xù)快速增長，臨床診斷甲狀腺結(jié)節(jié)性病變的方法較多，對疑似患者先進(jìn)行影像學(xué)診斷，如CT檢查、超聲檢查等，再行超聲引導(dǎo)下穿刺病理活檢。以外科手術(shù)為主的綜合治療是甲狀腺癌患者目前的主要治療手段，治療效果較好，但仍有患者發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［6］，面臨二次手術(shù)風(fēng)險。目前應(yīng)用于臨床的甲狀腺癌標(biāo)志物較少［17-18］，沒有理想的診斷及標(biāo)志物。AKR1B10是醛酮還原酶家族成員之一，主要還原內(nèi)源性代謝產(chǎn)生的和外源性攝入的醛酮類物質(zhì)，以保護(hù)細(xì)胞免受羰基毒性損傷，減少DNA損傷和突變。AKR1B10還可與乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）結(jié)合，保護(hù)后者泛素化途徑降解，從而促進(jìn)脂質(zhì)合成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。AKR1B10主要在正常胃上皮和腸道上皮組織中高表達(dá)，在其他組織中不表達(dá)或低表達(dá)［19］。

本研究發(fā)現(xiàn)，AKR1B10在PTC組織中陽性表達(dá)較率高，乳頭狀細(xì)胞起源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞，因此AKR1B10可能在濾泡上皮細(xì)胞癌變進(jìn)展過程中發(fā)揮一定作用。前期研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中AKR1B10可通過激活ERK信號通路，上調(diào)MMP2，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲［20］。本研究進(jìn)一步分析AKR1B10表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能與AKR1B10在乳腺癌中的作用類似，但仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究中男性患者的AKR1B10陽性表達(dá)率高于女性患者，原因不明。甲狀腺癌好發(fā)于女性，男女比例約為1∶3［21］，而本研究中男性患者較少，因此后期需增加男性患者例數(shù)驗(yàn)證此結(jié)果。

表2 AKR1B10表達(dá)水平與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Correlation analysis between AKR1B10 expression levels and clinicopathological parameters of PTC

本研究還發(fā)現(xiàn)，AKR1B10在40例橋本甲狀腺炎組織中表達(dá)較強(qiáng)，陽性表達(dá)率為75.0%，明顯高于甲狀腺正常組織及其他甲狀腺良性組織，但其與PTC組織中AKR1B10的陽性表達(dá)率（79.5%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文獻(xiàn)報(bào)道［22］，橋本甲狀腺炎患者較非橋本甲狀腺炎患者存在更高的甲狀腺癌發(fā)生風(fēng)險。說明橋本甲狀腺炎具有惡變成甲狀腺癌的可能，AKR1B10可能是評估橋本甲狀腺炎惡變的標(biāo)志物。

綜上所述，AKR1B10在甲狀腺乳頭狀癌組織中呈高表達(dá)，且與甲狀腺癌周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望作為評估轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，為臨床診療提供參考依據(jù)。