郭遠(yuǎn)薇 胡政 羅偉濠 賀榮章 李佳 段麗麗 劉小軍 羅迪賢

乳腺癌是來源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，也是我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。近年來隨著乳腺癌診療手段的改進(jìn)，其5年生存率明顯升高［1]。上海市乳腺癌臨床醫(yī)學(xué)中心的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌患者術(shù)后5年生存率從10年前的79.8%提高到89.9%，提高了10.1%。與同一時(shí)期國際權(quán)威機(jī)構(gòu)報(bào)道數(shù)據(jù)比較，美國乳腺癌患者5年生存率從2000年的84.0%提高到2010年的89.0%，上升了5.0%［2-4]，可見帶病生存的晚期乳腺癌患者占比越來越高。乳腺癌廣泛侵襲和轉(zhuǎn)移后未獲得及時(shí)有效的診治成為患者死亡的主要原因，因此通過多手段監(jiān)測(cè)，及時(shí)、有效地發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)以及準(zhǔn)確評(píng)估疾病進(jìn)展，有助于進(jìn)一步延長(zhǎng)患者的生存期。

目前諸多的癌癥相關(guān)腫瘤標(biāo)志物研究更著重于癌癥早篩早診，以使患者能在發(fā)病早期通過腫瘤擴(kuò)大根治手術(shù)進(jìn)行R0切除，從根本上改善患者的預(yù)后。然而目前針對(duì)乳腺癌早診早篩的大部分研究均未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。乳腺癌所有的早期篩查手段雖然可以在一定程度上降低其死亡率，但同時(shí)也有一定局限性［4-5]。因此，對(duì)于生存率不斷改善的乳腺癌血液循環(huán)標(biāo)本是諸多人體標(biāo)本中少數(shù)既滿足微創(chuàng)，又?jǐn)y帶豐富病情信息的活體標(biāo)本，是監(jiān)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)和病情評(píng)估更便捷、高效，且易獲取得的微創(chuàng)手段。循環(huán)腫瘤標(biāo)志物目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤患者的篩查、診斷、復(fù)查、治療效果評(píng)估等，本文就循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)腫瘤DNA（ciculating tumor，ctDNA）和外泌體等循環(huán)腫瘤標(biāo)志物的生物學(xué)特性及其在乳腺癌診療中的應(yīng)用展開綜述。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞在乳腺癌復(fù)發(fā)和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用

近年來研究最多的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物主要有CTCs和ctDNA。CTCs是指實(shí)體腫瘤原發(fā)病灶或者轉(zhuǎn)移病灶中脫落的進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的惡性腫瘤細(xì)胞［5]。CTCs在血循環(huán)中數(shù)量較少，但可發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），這使CTCs具有更強(qiáng)的變形和趨化能力，亦加速了腫瘤細(xì)胞播散轉(zhuǎn)移的速度［6]。CTCs還具有很強(qiáng)的細(xì)胞成團(tuán)能力，極易發(fā)展成循環(huán)腫瘤微栓（circulating tumor micro-plug，CTM），而 CTM 被認(rèn)為比 CTCs具有更高的轉(zhuǎn)移潛能力。CTCs還具有一定的自我種植能力，可在腫瘤細(xì)胞衍化生成的炎性因子（IL-6、IL-8）的趨化誘導(dǎo)作用下，依靠基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）和肌成束蛋白酶（FSCN1）滲透組織基底層再次回到腫瘤原發(fā)灶，進(jìn)行克隆性增殖。這一現(xiàn)象解釋了乳腺癌腫塊在完整切除后仍會(huì)復(fù)發(fā)的原因，可見CTCs是研究乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物（EMT標(biāo)志物，如Twist1、Akt2、PI3Kα等）在乳腺癌轉(zhuǎn)移患者中高表達(dá)，證明CTCs中存在攜帶腫瘤干細(xì)胞特性的亞群，并參與EMT過程［10-11]。此外，該研究還證實(shí)CTCs在轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路和叉頭框 C1（forkhead box C1，F(xiàn)OXC1）轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路的調(diào)控下參與動(dòng)態(tài)EMT過程。還有研究報(bào)道轉(zhuǎn)移性乳腺癌CTCs攜帶程序性死亡配體-1（programmed cell death-ligand1 PD-L1），是抗 PD-L1 治療的重要靶點(diǎn)［5，12]。2018年全球啟用的AJCC第八版癌癥分期系統(tǒng)，首次將乳腺癌外周血中的CTCs列為預(yù)后提示因子，并認(rèn)為EMT參與了癌癥的轉(zhuǎn)移過程［4]。此外，有研究證實(shí)，結(jié)合CTC總數(shù)和間質(zhì)型CTC比例的標(biāo)準(zhǔn)，可用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者治療耐藥性和預(yù)后監(jiān)測(cè)，同時(shí)明確了無進(jìn)展生存期（PFS）預(yù)測(cè)聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)：CTC總數(shù)≥10/5 mL、間質(zhì)型CTC比例＞10.7%，符合聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)的患者中位PFS明顯較不符合標(biāo)準(zhǔn)的患者短（6.2個(gè)月 vs9.9個(gè)月，P=0.010）［13]。以上研究表明CTCs是與乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的外周血循環(huán)腫瘤標(biāo)志物，有望為乳腺癌精準(zhǔn)診療提供依據(jù)。

2 ctDNA及其甲基化在乳腺癌復(fù)發(fā)與預(yù)后評(píng)估的應(yīng)用

ctDNA是指腫瘤患者血液來源的腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡或者分泌的DNA小片段，長(zhǎng)度一般不超過160～180 bp，明顯短于正常細(xì)胞內(nèi)的DNA，因此又稱為外周游離血DNA（cfDNA）。腫瘤患者血液中ctDNA含量遠(yuǎn)高于健康人，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［14]。有研究報(bào)道ctDNA的腫瘤特性如ctDNA最常見的點(diǎn)突變，使其有利于乳腺癌患者早期預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且發(fā)現(xiàn)p53、PIK3CA、ESR1等乳腺癌相關(guān)突變點(diǎn)，但因癌細(xì)胞的異質(zhì)性，隨著病情進(jìn)展突變點(diǎn)也會(huì)發(fā)生新的改變［15-16]，由此認(rèn)為ctDNA與乳腺癌復(fù)發(fā)和病情進(jìn)展有關(guān)，且發(fā)生于ctDNA突變可為后續(xù)治療提供新的靶點(diǎn)。因此，ctDNA不僅有利于乳腺癌的病情監(jiān)測(cè)，亦可為后續(xù)治療提供決策依據(jù)。

為了驗(yàn)證ctDNA能否用于監(jiān)測(cè)乳腺癌中的微小殘留病灶（minmal residnal disease，MRD），有研究者選取55例接受新輔助化療（new adjuvant chemotherapy，NCT）乳腺癌患者，完成明顯治愈性治療后在單個(gè)術(shù)后時(shí)間點(diǎn)或連續(xù)隨訪樣本中檢測(cè)ctDNA，發(fā)現(xiàn)可提高預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確性，其中連續(xù)隨訪樣本中的ctDNA檢測(cè)提高了復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的靈敏度，中位復(fù)發(fā)時(shí)間為7.9個(gè)月，進(jìn)一步證明了ctDNA的靶向捕獲測(cè)序分析可用于MRD檢測(cè)，且MRD測(cè)序較原發(fā)癌的測(cè)序可更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)后續(xù)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的發(fā)生發(fā)展，認(rèn)為ctDNA檢測(cè)可以識(shí)別具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的乳腺癌患者［15-17]。有研究發(fā)現(xiàn)在NCT期間，ctDNA水平迅速下降且在手術(shù)后未檢測(cè)到最小的殘留病灶，而NCT期間ctDNA水平的緩慢下降與較短的存活率密切相關(guān)［18]?？傊壳把芯空J(rèn)為無創(chuàng)突變追蹤外周血中ctDNA可以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)治療后的殘留MRD。

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt）作用下將甲基選擇性添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的過程，可調(diào)控基因表達(dá)是DNA重要的修飾途徑［19-20]。DNA甲基化是腫瘤發(fā)生過程中較早可觀察到的分子之一，常導(dǎo)致相對(duì)應(yīng)的抑癌基因失去活性，致使腫瘤發(fā)生發(fā)展［21]。血液中ctDNA的含量極少，在微量的ctDNA中檢測(cè)單個(gè)甲基化難度大，但已有學(xué)者將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于肝癌檢測(cè)［22]。目前關(guān)于ctDNA甲基化與乳腺癌的研究相對(duì)較少，有研究者在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)分析DNA甲基化可以區(qū)分上皮和間充質(zhì)表型，了解DNA甲基化如何在上皮和間充質(zhì)表型之間變化，有助于更合理地選擇基于甲基化的生物標(biāo)志物用于循環(huán)腫瘤DNA分析［23]。目前ctDNA越來越多地用于監(jiān)測(cè)癌癥治療期間的微小殘留病灶，但ctDNA的檢測(cè)依賴于特異性標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)用于評(píng)估微小殘留病灶的一些標(biāo)志物如AKR1B1和APC甲基化對(duì)上皮乳腺細(xì)胞系具有特異性，而在上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞系中亦均觀察到RASSF1A、RARβ、TWIST1和SFRP2甲基化，這支持了它們對(duì)多標(biāo)記組的適應(yīng)性［24]，因此開發(fā)類似的方法評(píng)估其他標(biāo)志物監(jiān)測(cè)DNA甲基化，可進(jìn)一步用于乳腺癌的ctDNA檢測(cè)。目前乳腺癌ctDNA甲基化研究仍處于早期階段，但早期乳腺癌細(xì)胞DNA甲基化以及ctDNA的研究使ctDNA甲基化具備良好的前期基礎(chǔ)，有望在不久的將來用于乳腺癌復(fù)發(fā)和晚期病情評(píng)估，為乳腺癌晚期患者提供新的治療靶點(diǎn)。

3 外泌體在乳腺癌復(fù)發(fā)與預(yù)后評(píng)估的應(yīng)用

外泌體（Exosome）是指經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸，從多泡體（multivesicularbody，MVB）排出到細(xì)胞外的直徑為30～100 nm的細(xì)胞外囊泡，在人體中可分布于血液、體液、唾液、乳汁、腦脊液等［25]。外泌體包含了miRNA、lnRNA、cirRNA、DNA以及蛋白質(zhì)等分子，且與細(xì)胞的功能狀態(tài)關(guān)系密切。此外，外泌體在生物學(xué)過程、疾病治療和診斷中扮演著重要角色，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中亦起著重要作用，近幾年外泌體被證實(shí)參與調(diào)控細(xì)胞表面蛋白以及多條細(xì)胞通路，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的傳導(dǎo)。而對(duì)于非哺乳期的乳腺癌患者而言，血清外泌體最易于獲取且其外泌體內(nèi)含物與患者病情密切相關(guān)。有研究表明，乳腺癌細(xì)胞外泌體囊泡內(nèi)的蛋白質(zhì)（CD39、CD73及TGF-β）和 miRNA（miR-122、miR-10b、miR-222及 miR-105）參與了乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等過程［26]。RICHES 等［27]研究發(fā)現(xiàn)正常乳腺上皮細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞外泌體的分泌是互為作用的反饋調(diào)節(jié)，即正常乳腺上皮細(xì)胞分泌的外泌體會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞分泌，反之亦然，提示密切檢測(cè)乳腺癌外泌體的變化可以有效及時(shí)地觀察乳腺癌治療療效以及評(píng)估復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。近年來非編碼RNA（miRNA、lnRNA、cirRNA）為惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，已有研究明確了非編碼RNA與腫瘤細(xì)胞分型、分化程度和預(yù)后的關(guān)系［25]。而絕大多數(shù)與腫瘤相關(guān)的非編碼RNA研究均需要取得新鮮的腫瘤標(biāo)本，血清外泌體則為非編碼RNA的研究提供了更便捷的方法。事實(shí)上隨著惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，血清外泌體中的非編碼RNA、DNA和蛋白質(zhì)含量和種類均會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。因此，血清外泌體也是乳腺癌復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和晚期病情評(píng)估的有效途徑，但仍需進(jìn)一步研究篩選靈敏度和特異度更高的標(biāo)志物，以獲得更為精準(zhǔn)的評(píng)估參數(shù)。

4 腫瘤血小板在乳腺癌復(fù)發(fā)與預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用

腫瘤血小板（tumor-educated platelets，TEPs）是一類含有與正常血小板不同RNA特殊血小板，可與腫瘤細(xì)胞發(fā)生相互作用［28]。TEPs是最近新發(fā)現(xiàn)的可作為腫瘤RNA的生物標(biāo)志物，被認(rèn)為參與腫瘤生長(zhǎng)的全身和局部反應(yīng)。TEPs參與多種實(shí)體瘤的進(jìn)展和擴(kuò)散，且TEPs RNA的剪接突變提示腫瘤的發(fā)生、發(fā)生部位和分子特征的特定信息［29-30]。目前，已有學(xué)者對(duì)來自不同腫瘤類型（包括肺癌、腦癌和乳腺癌）患者的TEPs樣本進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示腫瘤患者的TEPs與良性病變和其他非癌性疾病患者的TEPs不同［31-32]。但尚未清楚血小板如何“腫瘤化”，仍需進(jìn)一步探索導(dǎo)致血小板內(nèi)部RNA剪接的機(jī)制，以及特定血小板亞群之間相互變化與癌癥病情的相關(guān)性。有研究者通過283個(gè)血小板樣品的mRNA測(cè)序確定了TEPs與腫瘤的相關(guān)性，該研究對(duì)比了55名健康對(duì)照和228例有局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移腫瘤患者的TEPs，腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)96%，且發(fā)現(xiàn)在6種不同腫瘤類型中，原發(fā)腫瘤位置被正確識(shí)別，準(zhǔn)確率為71%［27，29]。該研究結(jié)果表明，腫瘤血小板與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、多發(fā)原位癌發(fā)生發(fā)展均有關(guān)，可能成為“液體活檢”的一部分，而用于乳腺癌的復(fù)發(fā)和晚期病情評(píng)價(jià)。

5 小結(jié)

乳腺癌的傳統(tǒng)預(yù)后和復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)指標(biāo)包括雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）等，基于此及乳腺癌分子分型，可幫助患者選擇內(nèi)分泌治療和靶向HER2治療。但是以上方法存在取材次數(shù)，檢測(cè)方法以及診斷主觀性強(qiáng)等缺點(diǎn)。乳腺癌病情進(jìn)展往往從微轉(zhuǎn)移開始，檢測(cè)乳腺癌患者微轉(zhuǎn)移狀態(tài)有助于早期定位復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的高危人群，對(duì)加強(qiáng)患者隨訪、采取相應(yīng)治療措施、減少腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及提高患者生存率具有重大意義［33]。骨髓中微轉(zhuǎn)移細(xì)胞即彌散腫瘤細(xì)胞雖然對(duì)乳腺癌患者具有獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值，但需要進(jìn)行侵入性較大的骨髓穿刺。而循環(huán)腫瘤標(biāo)志物（包括CTCs、ctDNA、ctDNA甲基化、外泌體以及TEP）檢測(cè)取材創(chuàng)傷小，且可同時(shí)檢測(cè)的標(biāo)志物種類較多，提供的病情信息更全面。長(zhǎng)久以來，TNM分期是乳腺癌病情評(píng)估和預(yù)后判斷的依據(jù)，也是患者手術(shù)指征的主要判斷標(biāo)準(zhǔn)。近年來隨著乳腺癌患者5年生存率不斷提高，TNM分期中晚期帶瘤生存的患者越來越多，而這些患者中部分患者的預(yù)后與TNM分期出入較大，因此有必要進(jìn)一步引入分子生物學(xué)分期。未來應(yīng)對(duì)循環(huán)腫瘤標(biāo)志物深入研究，將每一個(gè)循環(huán)腫瘤標(biāo)志物與乳腺癌患者的生存期和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行大樣本調(diào)查，以獲取更豐富的數(shù)據(jù)，從而制定更精準(zhǔn)的分期標(biāo)準(zhǔn)。而精確的分子生物學(xué)分期標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合經(jīng)典的TNM分期，有望為乳腺癌患者制定更符合其病情的診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)，從而更精確評(píng)估患者復(fù)發(fā)和晚期病情制定個(gè)體化治療方案。

綜上所述，循環(huán)腫瘤標(biāo)志物在乳腺癌復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)和晚期病情評(píng)估中有著良好的應(yīng)用前景，同時(shí)一些循環(huán)腫瘤標(biāo)志物的突變位點(diǎn)變化有望為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)，以及為乳腺癌患者個(gè)體化治療提供更多循證依據(jù)。但是目前外周血腫瘤循環(huán)標(biāo)志物高昂的檢測(cè)費(fèi)用，很大程度上限制了它在臨床的應(yīng)用，循環(huán)腫瘤標(biāo)志物與乳腺癌病情的關(guān)系，以及操作更簡(jiǎn)便、成本更低廉的檢測(cè)方法仍需進(jìn)一步研究，以改善晚期帶瘤生存患者的生存質(zhì)量。