趙立春 張亞玉 李小沛 呂林 劉繼永

摘要：通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選出人參多糖的最佳提取工藝條件。首先對(duì)人參多糖的3種提取方法（微波輔助熱水提取法、超聲輔助熱水提取法、索氏提取法）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，優(yōu)選出各自的4種因素及3個(gè)水平，再采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)3種提取方法分別進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并采用硫酸蒽酮比色法和硫酸苯酚比色法檢測(cè)多糖含量，通過(guò)比較人參多糖得率，確定最佳提取工藝。結(jié)果顯示，微波輔助熱水提取人參多糖最優(yōu)工藝組合如下：當(dāng)功率為400 W時(shí)，其料液比為1 g ∶50 mL、微波時(shí)間為3 min、提取時(shí)間為90 min、提取溫度為95 ℃，人參多糖的提取率為19.32%;超聲輔助熱水提取人參多糖的最優(yōu)工藝組合如下：當(dāng)超聲頻率為200 W時(shí)，其料液比為1 g ∶55 mL、超聲時(shí)間為25 min、超聲溫度為80 ℃、超聲次數(shù)為2次，人參多糖的提取率為34.12%;而索氏法提取人參多糖的最佳工藝條件為料液比1 g ∶20 mL、提取時(shí)間120 min、提取溫度100 ℃、提取次數(shù)2次，其多糖的提取率為24.13%。通過(guò)比較可知，超聲輔助熱水提取人參多糖的提取率最高，且時(shí)間短、節(jié)省能源、裝置簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便。

關(guān)鍵詞：人參多糖;提取工藝;正交設(shè)計(jì);微波輔助;超聲輔助;索氏提取

中圖分類號(hào)：S567.5+10.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0254-06

收稿日期：2018-08-02

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全——人參產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（編號(hào)：GJFP201801002）。

作者簡(jiǎn)介：趙立春（1992—），男，山東德州人，碩士研究生，主要從事藥用植物質(zhì)量評(píng)價(jià)與利用研究。E-mail：1453041608@qq.com。

通信作者：劉繼永，博士，研究員，主要從事藥用植物質(zhì)量評(píng)價(jià)與利用研究。E-mail：ljy1107@126.com。

人參（Panax ginseng C.A. Mey）為五加科（Araliaceae）人參屬（Panax）多年生草本植物，享有“百草之王”的美譽(yù)[1]。人參中化學(xué)成分復(fù)雜，包含人參皂苷、多糖、氨基酸、無(wú)機(jī)元素等[2]，在發(fā)揮其整體藥用價(jià)值的基礎(chǔ)上，單一化學(xué)成分具有其獨(dú)特的藥理活性。人參多糖（ginseng polysaecharide，簡(jiǎn)稱GPS）作為主要的活性成分之一，具有抗腫瘤、抗血栓、增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抗衰老、促進(jìn)造血功能等藥理作用[3-6]。以人參多糖為指標(biāo)性成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法眾多，主要有索氏提取法、超聲波輔助熱水提取法、微波輔助熱水提取法等[7-8]。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)，對(duì)上述3種提取方法分別進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期得到最優(yōu)工藝條件，為精準(zhǔn)評(píng)價(jià)人參質(zhì)量提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

鮮人參，為吉林撫松萬(wàn)良人參市場(chǎng)市售;苯酚、蒽酮、濃硫酸、D-無(wú)水葡萄糖、無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚等，均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自天津泰斯特儀器有限公司;光電微波爐，購(gòu)自格蘭仕微波爐電器有限公司;UV-2550紫外/可見分光光度計(jì)，購(gòu)自德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司;超聲波清洗器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司;萬(wàn)分之一電子天平，購(gòu)自梅特勒公司;HC-3018高速離心機(jī)，購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;索氏回流器等玻璃儀器，均購(gòu)自天津玻璃儀器廠。

1.3樣品處理

將鮮人參洗凈，用超純水清洗3遍，晾干，置于40 ℃烘箱，烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過(guò)60目篩，稱取適量人參粉末脫脂，按1 g ∶40 mL 比例加入無(wú)水乙醚，回流3 h，脫脂，備用。

1.4溶液配制

0.1%硫酸蒽酮溶液：精確稱取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL 溶解，搖勻，備用。

5%苯酚溶液：將固體苯酚于60 ℃水浴完全融化，精確吸取5 mL于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，備用。

D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液：精確稱取D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，加蒸餾水配制成濃度為0.12 mg/mL的溶液。

1.5供試樣品溶液制備

精確稱取樣品2 g，置于圓底燒瓶中。按照L9（34）正交設(shè)計(jì)，過(guò)濾收集濾液，分3次洗滌濾渣，最終將濾液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿。水浴蒸干，其殘?jiān)? mL熱蒸餾水溶解，再邊攪拌邊加入無(wú)水乙醇75 mL，將其轉(zhuǎn)移至聚乙烯離心管中，放置于4 ℃ 冰箱中12 h，于4 ℃、6 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀再加蒸餾水溶解，重復(fù)醇沉3次。轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用冷卻蒸餾水定容，取適量溶液，離心取上清液2 mL，至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻備用。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.6.1硫酸蒽酮比色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，緩慢加入0.1%硫酸蒽酮溶液6 mL，立即搖勻，放置15 min，冰浴15 min，取出，以相應(yīng)的空白作對(duì)照，在波長(zhǎng)625 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2硫酸苯酚比色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取對(duì)照品溶液于10 mL 具塞試管中，定容至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，再緩慢滴加濃硫酸5 mL，迅速振搖混勻，于室溫下靜置10 min，立即放于沸水中20 min，取出，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7樣品測(cè)定

精確量取待測(cè)樣品溶液2 mL于10 mL具塞試管中，設(shè)置2組重復(fù)，按“2.4”節(jié)方法測(cè)定，按照以下公式計(jì)算多糖的提取率[9]。人參粗多糖提取率=人參粗多糖含量（g）/原料人參質(zhì)量（g）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1微波輔助熱水提取法

微波輔助熱水提取法提取人參多糖較優(yōu)于直接熱水提取法，其影響因素有微波功率、料液比、微波時(shí)間、提取時(shí)間、提取溫度等[9-10]。參照表1進(jìn)行單一因素試驗(yàn)，選擇最佳工藝因素和水平。單因素試驗(yàn)所形成的多糖提取率趨勢(shì)見圖1至圖5。

2.1.2超聲輔助熱水提取法

超聲輔助提取人參多糖是一種較為高效的提取人參多糖的方法。據(jù)報(bào)道，試驗(yàn)的影響因素較多，有超聲功率、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲次數(shù)等[11-13]。按表2條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察因素對(duì)于結(jié)果的影響，選擇最佳因素及水平。由圖6至圖10可以看出超聲功率、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲次數(shù)等因素對(duì)于人參多糖提取率的影響。將超聲功率為200W設(shè)定為固定條件，選擇其他4個(gè)因素的合適水平，建立4因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)選超聲輔助法提取人參多糖的最佳工藝條件。

2.1.3索氏提取法

索氏法提取人參中多糖的操作較為簡(jiǎn)單，但是耗時(shí)較長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等會(huì)在不同程度上對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生影響[14-15]。按表3條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察最佳工藝因素和水平。

在控制其他因素的基礎(chǔ)上形成單一變量，研究其對(duì)于試驗(yàn)的影響。由圖11至圖14可以看出浸提溫度、料液比、浸提時(shí)間、提取次數(shù)等試驗(yàn)因素對(duì)人參多糖提取率的影響。選擇4種試驗(yàn)因素的合適水平，建立4因素3水平正交試驗(yàn)（表4），優(yōu)選索氏法提取人參多糖的最佳工藝條件。

2.2正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)，采用L9（34） 4因素3水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化人參多糖提取工藝參數(shù)。因素水平見表4。

2.2.1微波輔助熱水提取法

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）、吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)硫酸蒽酮比色法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.037X-0.013 3，r2=0.999 7。通過(guò)硫酸苯酚比色法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.039 8X+0.044 6，r2=0.999 3。

由表5可知，在微波輔助提取人參多糖的試驗(yàn)中，對(duì)于試驗(yàn)所得2種比色方法檢測(cè)的多糖提取率，雖然試驗(yàn)結(jié)果不盡相同，但是其各自的最優(yōu)組合相符。最優(yōu)工藝組合為第8組（A3B2C1D3），即當(dāng)微波功率為400 W時(shí)，最佳工藝條件為料液比1 g ∶50 mL、微波時(shí)間3 min、提取時(shí)間90 min、提取溫度95 ℃。

使用SAS 9.0對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表6得出，4種試驗(yàn)因素對(duì)于人參多糖的提取率都有顯著影響。其對(duì)于試驗(yàn)的影響力排序?yàn)槲⒉〞r(shí)間>提取時(shí)間>提取溫度>料液比。

2.2.2超聲輔助熱水提取法以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X）、吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)硫酸蒽酮比色法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.064 0X-0.090 3，r2=0.999 2。通過(guò)硫酸苯酚比色法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.039 6X+0.032 5，r2=0.999。

由表7可知，在本試驗(yàn)中2種比色法所得最優(yōu)組合相符，即最優(yōu)試驗(yàn)組合為第7組（A3B1C3D2），最佳工藝條件為料液比1 g ∶55 mL、超聲時(shí)間25 min、超聲溫度80 ℃、超聲次數(shù)2次。

使用SAS 9.0對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表8得出，4種因素對(duì)于本試驗(yàn)的影響力排序?yàn)槌暅囟?超聲時(shí)間>超聲次數(shù)>料液比。對(duì)于整個(gè)試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，4種試驗(yàn)因素對(duì)于人參多糖的提取率影響最高的為超聲溫度。

2.2.3索氏提取法

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X）、吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)硫酸蒽酮比色法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.028 1X+0.056 9，r2=0.999 4。通過(guò)硫酸苯酚比色法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.066 6X-0.012 7，r2=0.999 9。

由表9可知，在索氏提取法提取人參多糖的試驗(yàn)中，2種比色法的最優(yōu)組合相符，都為第5組（A2B2C3D1），最佳工藝條件為料液比1 g ∶20 mL、提取時(shí)間120 min、提取溫度100 ℃、提取次數(shù)2次。

由表10的方差分析結(jié)果得出，對(duì)于整個(gè)試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，4種試驗(yàn)因素對(duì)于人參多糖的提取率都有顯著影響，其影響力排序?yàn)樘崛〈螖?shù)>提取溫度>提取時(shí)間>料液比。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，用優(yōu)選出的3種提取方法的最佳提取工藝條件進(jìn)行人參多糖的提取，同時(shí)設(shè)置3組重復(fù)，求其平均值，比較并選擇人參多糖的最佳提取工藝，結(jié)果見表11。

如表11所示，對(duì)3次重復(fù)試驗(yàn)所得值求平均，其平均值與正交試驗(yàn)所得結(jié)果大致相同，說(shuō)明試驗(yàn)的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，最佳工藝的試驗(yàn)重復(fù)性較好。

3結(jié)論

通過(guò)對(duì)整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果分析得出，超聲輔助熱水提取法以提取率35.05%、34.12%的結(jié)果明顯高于其他2種方法;超聲輔助熱水提取法明顯優(yōu)于其他2種方法的最優(yōu)組合，且該方法具有時(shí)間短、節(jié)省能源、 操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)品提取率高等優(yōu)點(diǎn)。能夠滿足工廠化的需要。

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