羅行煒 孫華潤 魏單單 朱瑩瑩 徐引弟 賀丹丹 劉建華 潘玉善 吳華 苑麗 胡功政

摘要：為探究豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）臨床分離株對氟苯尼考（FFC）的耐藥性及floR基因的流行與分布情況，收集河南、湖北、江西、陜西、湖南、山西、安徽等7個省份合作豬場送檢的病死豬肺臟、脾臟、支氣管黏液等206份病料樣本，從中分離APP并鑒定，采用微量肉湯稀釋法測定分離菌株對FFC的敏感性，PCR及測序方法檢測floR基因，并用隨機(jī)引物PCR（AP-PCR）方法分析臨床分離菌株之間的同源性。結(jié)果表明，成功分離鑒定了APP 28株，分離率為13.59%。4株APP對FFC耐藥，耐藥率為14.29%;15株攜帶floR基因，floR檢出率為53.57%，高于APP對FFC的耐藥率;有11株分離菌floR陽性但對FFC并不耐藥。分析RAPD系統(tǒng)樹狀圖發(fā)現(xiàn)，28株APP被分為幾乎無核苷酸同源性的A和B 2大類、25種RAPD型，其中A類25株，分22種RAPD型，14株攜帶floR基因，這些菌株間的核苷酸同源性為40%～80%;B類3株，分3種RAPD型，1株攜帶floR基因。本研究提示APP的floR基因主要以水平方式傳播。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌;PCR;耐藥性;floR基因;隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）

中圖分類號： S852.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0228-04

收稿日期：2018-08-09

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2016YFD0501304）。

作者簡介：羅行煒（1993—），男，河南光山人，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。E-mail：1272376863@qq.com。

通信作者：胡功政，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。E-mail：yaolilab@163.com。

豬傳染性胸膜肺炎是一種高度特異性傳染性豬呼吸道類疾病，在我國集約化養(yǎng)殖場尤為多見，引起該病發(fā)生的病原為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）。我國自1987年首次發(fā)現(xiàn)此病例以來，某些地區(qū)已成功分離鑒定出病原菌APP[2-5]，如錦州地區(qū)[2]、江蘇泰興[3]、湖北[4]、貴州[5]等。近年，APP臨床分離株的耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，其中APP對氟苯尼考（FFC）的耐藥性也已受到國內(nèi)外專家學(xué)者的關(guān)注[5-11]。FFC作為動物專用的酰胺醇類廣譜抗生素，對APP的最小抑菌濃度為0.20～1.56 μg/mL，主要用于巴氏桿菌引起的牛呼吸道感染、豬傳染性胸膜肺炎、雞大腸桿菌病等[6]。細(xì)菌對FFC等酰胺醇類藥物耐藥的機(jī)理之一在于floR基因的介導(dǎo)，即floR基因編碼耐FFC或氯霉素的外排泵蛋白，從而導(dǎo)致這類藥物很難進(jìn)入或不能進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)發(fā)揮作用[12]。

由于菌株分離時間及分離地點的不同，導(dǎo)致不同地域或不同季節(jié)的APP分離株對FFC的耐藥情況呈現(xiàn)較大差異。本研究對來自河南（焦作、中牟、安陽等）、湖北、江西、陜西、湖南、山西、安徽等7個省份疑似病豬的肺臟、脾臟、支氣管等病變組織進(jìn)行目的菌分離鑒定，測定APP分離株對FFC的敏感性，進(jìn)一步檢測其floR基因的攜帶情況，并運(yùn)用隨機(jī)引物PCR（AP-PCR）技術(shù)檢測APP的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）圖譜，根據(jù)聚類結(jié)果分析分離株的同源性，為集約化養(yǎng)豬場合理使用FFC及進(jìn)一步研究APP分離株floR基因的傳播機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料的采集

病料主要來自河南（焦作、中牟、安陽等）、湖北、江西、陜西、湖南、山西、安徽等7個省份地區(qū)養(yǎng)豬場的患病豬，取病變的肺臟、脾臟、支氣管等組織樣品，共206份。

1.1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株

APP標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC27090），購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.1.3培養(yǎng)基及相關(guān)試劑

培養(yǎng)基：胰蛋白大豆?fàn)I養(yǎng)瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）、巧克力色血瓊脂平板，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。其中，TSA和TSB均分別加0.01% NAD和5%血清。

新生小牛血清，購自北京索萊寶生物科技有限公司。

相關(guān)試劑：2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、DSTM2000 DNA Marker，均購自康為世紀(jì)（北京）生物科技有限公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、50×TAE、1×TE（pH值=80），均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

各種生化鑒定管（試劑），購自山東青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4引物設(shè)計與合成

APP的所有血清型中都存在ApxⅣ基因，在GenBank上下載ApxⅣ基因片段序列（登錄號：AF021919.1），設(shè)計并合成ApxⅣ擴(kuò)增引物;floR引物參照Bossé等的試驗[8];AP-PCR的引物參照Lee等的試驗[13]，引物序列見表1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.5藥物

氟苯尼考原料（英文簡稱：FFC;含量：95%），由河南牧翔動物藥業(yè)有限公司提供，有效期內(nèi)進(jìn)行使用。

1.2方法

1.2.1病原菌分離與鏡檢

在無菌超凈操作臺中，分別從豬的肺臟、脾臟、支氣管等病料組織中取樣，劃線接種于巧克力色血瓊脂平板和TSA平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h。觀察細(xì)菌的菌落形態(tài)，挑取疑似APP菌落接種于TSB中。經(jīng)多次接種純化培養(yǎng)，將已分離純化的菌株進(jìn)行革蘭染色，在油鏡下觀察并記錄菌體的形態(tài)特征。

1.2.2分離菌株的生化試驗鑒定

將純化后的細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于含0.01% NAD和5%血清的生化鑒定管中，然后置于37 ℃、10% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果。

1.2.3分離菌株的PCR鑒定

挑取純化后的單菌落，于TSB中接種，氣浴恒溫?fù)u床進(jìn)行37 ℃培養(yǎng)20～24 h后，菌液PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Taq Master Mix12.5 μL，ApxⅣ上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 3.0 μL，ddH2O7.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。分別以TSB和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27090為陰性或陽性對照。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，陽性PCR產(chǎn)物回收，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST進(jìn)行比對。

1.2.4藥物儲備液配制

采用分析天平精確稱取適量FFC，再采用高壓后的去離子水（適量添加助溶劑N，N二甲基亞酰胺及乙醇）配制初始濃度為5 120 μg/mL的儲備母液，置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5藥敏試驗

參照臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法測定FFC對分離菌株的最小抑菌濃度（MIC）[14]，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀并計算MIC50、MIC90和耐藥率。以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27090為質(zhì)控菌。

1.2.6細(xì)菌基因組DNA的制備

將APP菌株接種于TSB中，37 ℃培養(yǎng)10～12 h，離心收集菌體后用300 μL 1×TE（pH值=8.0）緩沖液重懸菌體，煮沸10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，上清即為細(xì)菌基因組，用1.5 mL Eppendorf管收集，-20 ℃儲存。

1.2.7floR基因檢測

以APP分離株基因組DNA為模板，設(shè)計相關(guān)引物（表1）進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)體系：2×PCR Taq Master Mix 10 μL，floR基因上、下游引物各1 μL，ddH2O6 μL，菌株DNA 2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，63.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán);72 ℃ 終延伸10 min;4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳后，陽性PCR產(chǎn)物回收并送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對。

1.2.8隨機(jī)引物PCR（AP-PCR）

APP分離株的RAPD圖譜是運(yùn)用AP-PCR技術(shù)確定的，以提取DNA作為模板，設(shè)計引物AP進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AP-PCR的反應(yīng)體系：2×PCR Taq Master Mix 10 μL，引物1 μL，菌株DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán);72 ℃終延伸10 min;4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳，并用生物電泳凝膠成像系統(tǒng)生成電泳圖后，再用GelComparⅡ 6.6軟件對此隨機(jī)引物擴(kuò)增出的各菌株DNA條帶進(jìn)行整合，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹狀圖。根據(jù)聚類結(jié)果，以APP的相似性系數(shù)進(jìn)行分型，大于80%的判定為同一種RAPD型，小于80%的判定為不同的型[15]，見表1。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的分離鑒定

2.1.1分離菌株的培養(yǎng)特性

分離菌株經(jīng)37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～20 h后，在巧克力色血瓊脂平板上菌落為濁白色、圓形隆起，直徑大小為1～2 mm，在TSA平板上菌落半透明、表面光滑、邊緣整齊，菌落直徑在1 mm左右（圖1），普通瓊脂培養(yǎng)基上不生長。

挑取典型菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，油鏡下可見革蘭陰性小球桿菌，菌體較小，多散在桿狀，符合APP的形態(tài)和染色特征（圖2）。

2.1.2分離菌株的生化試驗鑒定結(jié)果

生化試驗鑒定結(jié)果顯示，分離菌株均可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和甘露糖，但不發(fā)酵乳糖、阿拉伯糖、甘露醇和麥芽糖。尿酶試驗和過氧化氫試驗呈陽性，吲哚試驗和硫化氫試驗呈陰性。生化試驗結(jié)果與文獻(xiàn)上報道的APP分離株生化試驗結(jié)果相吻合。

2.1.3分離菌株的PCR鑒定結(jié)果

采用ApxⅣ毒素基因的特異性引物對分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得預(yù)期長度（442 bp）的特異性條帶（圖3），測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，與ApxⅣ毒素基因（GenBank登錄號AX002405）的同源率達(dá)到99%以上。

2.2藥敏試驗結(jié)果

參照CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)[14]，F(xiàn)FC對APP的折點為S≤2;I=4;R≥8（S表示敏感;I表示中介;R表示耐藥）。FFC質(zhì)控APP的允許范圍為0.25～1.00 μg/mL，本次制備的藥物儲備液測試質(zhì)控菌ATCC27090的MIC<0.5 μg/mL，均符合要求。由表2可知，4株APP對FFC耐藥，耐藥率為14.29%（4/28），MIC范圍介于≤0.5～256.0 μg/mL。

2.3floR基因檢測結(jié)果

分離鑒定的28株APP有15株攜帶floR基因，檢出率為53.57%（15/28）。由圖4可知，目的條帶位于510 bp 處，回收目的條帶測序并進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GenBank已上傳的大腸桿菌floR基因（GenBank登錄號：EF429662）同源性高達(dá)99%。將floR基因的測序結(jié)果整理后上傳到GenBank，取得的GenBank序列號為MG920811。

2.4隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）

AP-PCR研究發(fā)現(xiàn)，28株APP共被分成A和B 2大類，由圖5可見，2類間幾乎不存在同源性。來自河南、湖北、江西、陜西、湖南、山西、安徽等7個省份的分離株核苷酸親緣差異性跨度較大，大部分菌株間的同源性為40%～80%，表明此大多數(shù)APP分離株是不同的RAPD型。其中，A類有25株，其中14株攜帶floR基因，核苷酸同源性達(dá)80%以上的菌株有6株，分別為170313-1F9、171103-1P1、171103-2F1、171103-3F3、170313-2F4和1144，該6株可分為3種RAPD型，剩下19株每株各1個RAPD型，共22種型;B類有3株，共3種RAPD型，有1株攜帶floR基因。A和B 2大類28株APP共被分為25種RAPD型。

3討論

APP是豬傳染性胸膜肺炎的特異病原菌，其可與其他病原菌繼發(fā)感染此呼吸道疾病，如巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌等，也可繼發(fā)病毒性疾病，如豬繁殖與呼吸障礙綜合征、偽狂犬病毒病等。該病原菌無明確的選擇性培養(yǎng)基，所以在分離鑒定時很難除去雜菌，純化難度大，導(dǎo)致此菌不能或很難分離[16]。APP對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件要求特殊，且生長緩慢，菌落含菌量少。若應(yīng)用槍尖法（采用移液槍槍尖直接沾取少量細(xì)菌固體培養(yǎng)物于PCR管中，加PCR試劑進(jìn)行反應(yīng)）不利于PCR擴(kuò)增。根據(jù)PCP流行病學(xué)特點，本研究主要于3—4月及9—12月集中分離病原菌并從206份病料（患豬肺臟、脾臟、支氣管等）中成功分離鑒定出28株APP。鑒定關(guān)鍵是充分運(yùn)用菌液PCR檢測技術(shù)，來源于Schaller等根據(jù)ApxⅣ基因設(shè)計引物建立的方法[1]。

近年，國內(nèi)集約化養(yǎng)殖場對抗生素的需求量越來越大，甚至長期使用抗生素治療、控制養(yǎng)殖場的患病豬。臨床上，細(xì)菌對抗菌藥不敏感的現(xiàn)象屢見不鮮，甚至出現(xiàn)高強(qiáng)度耐藥或多重耐藥，包括APP對FFC耐藥，如車勇良等分離鑒定的APP對FFC出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[17]等。APP對FFC的耐藥性還可能與地域有關(guān)，例如Kucerova等從分離的APP中檢測出對FFC耐藥率為0.8%，并從所有耐FFC的菌株中均檢測出floR基因[7]。王濤等報道其在蘇北地區(qū)分離鑒定的3株APP對FFC高度敏感[18]。Bossé等從耐FFC的APP中提取質(zhì)粒（pM3446F）測得序列并表明含有floR基因[8]。張東超等在天津某規(guī)模豬場分離鑒定的APP臨床株中，測試其藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn)對FFC高度敏感[19]。國外也報道過APP的臨床分離株對FFC敏感[9-11]。APP對FFC耐藥最根本的原因是菌株體內(nèi)floR等基因的表達(dá)導(dǎo)致其對FFC耐藥。

本試驗測試分離株APP對FFC的耐藥率為14.29%，但floR的檢出率（53.57%） 顯著高于APP對FFC的耐藥率?這顯然說明floR基因在部分APP體內(nèi)不表達(dá)或低表達(dá)，因此導(dǎo)致其對FFC不能耐藥。FFC作為動物專用廣譜抗生素，本研究表明其對多數(shù)APP的抗菌活性較高，在臨床對治療APP感染仍有較高的應(yīng)用價值。floR基因在國外APP中有研究報道[20-21]，但在國內(nèi)APP分離株中尚未見有檢出的報道，而本研究在國內(nèi)首次檢測出floR基因，floR基因在APP中的檢出應(yīng)引起重視。

目前，細(xì)菌基因分型的方法主要包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）、多位點序列分型（MLST）、腸桿菌基因間重復(fù)序列PCR（ERIC-PCR）和基因外重復(fù)回文序列PCR（REP-PCR）等。本研究采用的RAPD分型方法簡單易行，是由Williams等在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上首創(chuàng)的1種基因分型方法，運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增以尋找多態(tài)性DNA片段，其擴(kuò)增周期短且無放射性，可用肉眼觀察[22]。RAPD的條帶越相近，說明其核苷酸的同源性越高，親緣性越近，為克隆傳播。采用GelComparⅡ6.6軟件生成進(jìn)化樹狀圖，發(fā)現(xiàn)此分離株共被分成幾乎不存在同源性的兩大類（A和B類）。A類被分為22種型，B類被分為3種型，共25種RAPD型。攜帶floR基因的菌株大多集中在A類，且含floR基因的菌株核苷酸同源性多在40%～80%間，表明來自不同省份分離株的核苷酸同源性差異較大，含有floR基因菌株間的核苷酸的同源性較低，說明攜帶floR基因的APP臨床分離株之間的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，多數(shù)來自不同的克隆，floR基因在試驗菌株間主要是以水平方式傳播。

參考文獻(xiàn)：

[1]Schaller A，Djordjevic S P，Eamens G J，et al. Identification and detection of Actinobacillus pleuropneumoniae by PCR based on the gene apxIVA[J]. Veterinary Microbiology，2001，79（1）：47-62.

[2]隋慧. 錦州地區(qū)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離與鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（6）：3366-3367.

[3]葛兆宏，陸廣富，陶潔，等. 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌變異株的分離與鑒定[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2012，33（4）：10-13.

[4]田永祥，檀永強(qiáng)，劉澤文，等. 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定、致病性與藥敏試驗[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（21）：5204-5207.

[5]余波，楊莉，王芳，等. 貴州省豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌核酸檢測及其耐藥性調(diào)查[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（6）：128-130.

[6]陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學(xué)[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：252-253.

[7]Kucerova Z，Hradecka H，Nechvatalova K，et al. Antimicrobial susceptibility of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates from clinical outbreaks of porcine respiratory diseases[J]. Veterinary Microbiology，2011，150（1/2）：203-206.

[8]Bossé J T，Li Y，Atherton T G，et al. Characterisation of a mobilisable plasmid conferring florfenicol and chloramphenicol resistance in Actinobacillus pleuropneumoniae[J]. Veterinary Microbiology，2015，178（3/4）：279-282.

[9]Priebe S，Schwarz S. In vitro activities of florfenicol against bovine and porcine respiratory tract pathogens[J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy，2003，47（8）：2703-2705.

[10]Gutiérrez-Martín C B，Blanco N D，Blanco M，et al. Changes in antimicrobial susceptibility of Actinobacillus pleuropneumoniae，isolated from pigs in Spain during the last decade[J]. Veterinary Microbiology，2006，115（1）：218-222.

[11]Matter D，Rossano A，Limat S，et al. Antimicrobial resistance profile of Actinobacillus pleuropneumoniae and Actinobacillus porcitonsillarum[J]. Veterinary Microbiology，2007，122（1/2）：146-156.

[12]Schwarz S，Kehrenberg C，Doublet B，et al. Molecular basis of bacterial resistance to chloramphenicol and florfenicol[J]. FEMS Microbiology Reviews，2004，28（5）：519-542.

[13]Lee J H，Choi S J. Isolation and characteristics of sorbitol-fermenting Escherichia coli O157 strains from cattle[J]. Microbes and Infection，2006，8（8）：2021-2026.

[14]Watts J L. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibilty tests for bacteria isolated from animals：approved standard[M]. 4th ed. Wayne：Clinical and Laboratory Standards Institute，2013.

[15]Liu B，Wu H，Zhai Y，et al. Prevalence and molecular characterization of oqxAB in clinical Escherichia coli isolates from companion animals and humans in Henan Province，China[J]. Antimicrobial Resistance & Infection Control，2018，7（1）：18.

[16]余光勇. 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及ApxⅠA、TbpB基因的克隆和原核表達(dá)研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[17]車勇良，陳如敬，吳學(xué)敏，等. 豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 養(yǎng)豬，2016（6）：102-104.

[18]王濤，陳廣仁，蔡丙嚴(yán). 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定與藥敏試驗[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（10）：207-208.

[19]張東超，楊寧寧，林靜，等. 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（6）：1604-1609.

[20]Da Silva G C，Rossi C C，Santana M F，et al. p518，a small floR plasmid from a South American isolate of Actinobacillus pleuropneumoniae[J]. Veterinary Microbiology，2017，204：129-132.

[21]Li Y H，Li Y W，Crespo R F，et al. Characterization of the Actinobacillus pleuropneumoniae SXT-related integrative and conjugative element ICEApl2 and analysis of the encoded FloR protein：hydrophobic residues in transmembrane domains contribute dynamically to florfenicol and chloramphenicol efflux[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2018，73（1）：57-65.

[22]Williams J G，Kubelik A R，Livak K J，et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Research，1990，18（22）：6531-6535.