王婷 陳茂婷 王卓源 周丹 王光志

摘要：通過(guò)系統(tǒng)測(cè)定烏頭霜霉病病原菌的生物學(xué)特性，研究其致病力，為烏頭霜霉病的深入研究和防治提供理論依據(jù)。采用懸滴法研究環(huán)境條件溫度、pH值、碳源對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響，采用硫酸法控制小容器內(nèi)相對(duì)濕度，測(cè)定相對(duì)濕度對(duì)孢子囊萌發(fā)的影響，并用離體葉盤(pán)法接種霜霉菌孢子囊懸浮液觀察烏頭發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。結(jié)果顯示，孢子囊在4～25 ℃范圍內(nèi)均可萌發(fā)，18 ℃時(shí)萌發(fā)率最高;相對(duì)濕度低于95%時(shí)孢子囊不能萌發(fā)，在相對(duì)濕度為100%時(shí)孢子囊萌發(fā)率最高，水分為孢子囊萌發(fā)的必需條件;孢子囊在pH值為5.74～8.06的條件下均可萌發(fā)，且在pH值為5.93 時(shí)萌發(fā)率最高;在4種供試碳源的培養(yǎng)條件下，孢子囊都可萌發(fā)，其中可溶性淀粉培養(yǎng)條件下孢子囊萌發(fā)率最高。接種48 h后，葉背面初現(xiàn)水漬狀病斑，2.5 d后可以看到明顯病斑，呈彌散型，7 d后病斑開(kāi)始?jí)乃?。觀察期內(nèi)，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，病情指數(shù)逐漸升高。該研究明確了不同環(huán)境條件下烏頭霜霉病病原菌的生物學(xué)特性，為該病的深入研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：烏頭;霜霉病;病原菌;孢子囊;生物學(xué)特性;致病力;離體葉盤(pán)法;病情指數(shù)

中圖分類號(hào)： S435.67文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0172-03

收稿日期：2018-08-20

基金項(xiàng)目：四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：15ZA0098）。

作者簡(jiǎn)介：王婷（1993—），女，四川達(dá)州人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源學(xué)。E-mail：1747817056@qq.com。

通信作者：王光志，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源學(xué)。E-mail：kzwon@163.com。

烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）為毛茛科烏頭屬藥用植物，其干燥母根稱川烏，子根的加工品稱附子，均為川產(chǎn)道地藥材，療效好，用量大。烏頭在四川省栽培面積廣，在道地產(chǎn)區(qū)江油地區(qū)有1 900多年的種植歷史。在多年栽培過(guò)程中，烏頭病害頻發(fā)，其中以根腐病、白絹病、霜霉病對(duì)產(chǎn)量的影響較大。霜霉病在苗期尤為普遍，一般發(fā)病率為3%～20%，最高達(dá)30%[1];烏頭霜霉病具有發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)的特點(diǎn)，重病苗最后褐化枯死，造成缺株，對(duì)附子藥材的產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響，也對(duì)藥農(nóng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。余永年在1979年首次對(duì)烏頭霜霉病進(jìn)行報(bào)道，將該病病原菌鑒定為烏頭霜霉Peronospora aconiti Yu[2]，該菌為專性寄生真菌。筆者所在課題組前期對(duì)四川省江油地區(qū)烏頭種植基地感病烏頭做了初步探索研究，根據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)特征以及rDNA-ITS區(qū)序列對(duì)其進(jìn)行了鑒定[3]。本研究探討了烏頭霜霉病致病菌的生物學(xué)特性和致病性特征，以期進(jìn)一步為該病害的深入研究提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集

烏頭霜霉病病葉采自四川省江油市太平鎮(zhèn)普照村附子種植基地（104°41′27″E、31°43′47″N），海拔512 m。病葉采集后裝于無(wú)菌密封袋中，置于采樣箱中帶回。健康葉采自成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園內(nèi)栽培的健康植株。以上供試材料的來(lái)源均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室王光志教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭（A. carmichaeli Debx.）。

1.2孢子囊懸浮液制備

用流動(dòng)自來(lái)水將采集病葉表面的泥土等雜質(zhì)沖洗干凈，經(jīng)無(wú)菌蒸餾水潤(rùn)洗后用滅菌濾紙吸干表面水分，在18 ℃、相對(duì)濕度為100%的黑暗條件下過(guò)夜培養(yǎng)[4]。培養(yǎng)后用無(wú)菌毛刷刷下新鮮孢子囊，以無(wú)菌蒸餾水配制新鮮孢子囊懸浮液，4層滅菌紗布過(guò)濾即得。

1.3烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)方式觀察

參照崔鐵軍等的方法[5]并稍作改動(dòng)，新鮮孢子囊懸浮液在18 ℃下培養(yǎng)24 h后吸取少量懸浮液制片并于顯微鏡下觀察。

1.4烏頭霜霉病病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.4.1溫度對(duì)烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)的影響

懸滴法培養(yǎng)新鮮孢子囊懸浮液[6]。分別置于溫度為0、4、10、16、18、22、25 ℃下，于3、6、8、12、24 h后分別鏡檢孢子囊萌發(fā)率，每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)觀察不少于200個(gè)孢子囊。

1.4.2相對(duì)濕度對(duì)烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)的影響

采取新發(fā)病葉片，將孢子囊彈撒在載玻片上，在干燥器內(nèi)用硫酸法控制濕度[7]，置于相對(duì)濕度分別為90%、95%、98%、100%的干燥器中，18 ℃下培養(yǎng)，以蒸餾水為對(duì)照，3、5、10、24、36 h后分別鏡檢孢子囊萌發(fā)率。每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)觀察不少于200個(gè)孢子囊。

1.4.3pH值對(duì)烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)的影響

用Na2HPO4和NaH2PO4配制pH值5.74～8.06范圍內(nèi)7個(gè)不同梯度的磷酸緩沖液，室溫下懸滴法培養(yǎng)，3、6、9、12、24 h后鏡檢孢子囊萌發(fā)率。每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)觀察不少于200個(gè)孢子囊。

1.4.4碳源對(duì)烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)的影響

用無(wú)菌蒸餾水分別配制葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉及甘油溶液，使其濃度均為5%，室溫下懸滴法培養(yǎng)，3、6、9、12、24 h后鏡檢孢子囊萌發(fā)率。每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)觀察不少于200個(gè)孢子囊。

1.5烏頭霜霉病病原菌的致病力研究

取健康烏頭植株頂端第2張至第3張真葉，自來(lái)水沖洗干凈表面雜質(zhì)，75%乙醇浸泡30 s，滅菌蒸餾水潤(rùn)洗3次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分[8]。健康葉片消毒后，取葉尖部分制成直徑為10 mm的葉盤(pán)。將葉盤(pán)和完整葉片放入0.8%水瓊脂培養(yǎng)皿中，每皿5個(gè)葉盤(pán)或1張整葉，葉背朝上。每個(gè)葉盤(pán)點(diǎn)滴法接種35 μL孢子囊懸浮液，整葉均勻點(diǎn)接孢子囊懸浮液，每點(diǎn)5 μL，對(duì)照組接種等量滅菌蒸餾水[9]。接種后放置于18 ℃、相對(duì)濕度為100%的培養(yǎng)箱中，12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)。每天觀察并拍照記錄離體健康葉的變化，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)（烏頭霜霉分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1），7 d后每天取1組葉片撕取表皮進(jìn)行顯微觀察，直至葉片壞死。

2結(jié)果與分析

2.1烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)方式

如圖1所示，孢子囊以形成芽管的方式萌發(fā)，可產(chǎn)生1個(gè)或2個(gè)芽管，芽管可形成分支，未見(jiàn)游動(dòng)孢子囊形成。

2.2溫度對(duì)烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)的影響

在供試溫度范圍內(nèi)，0 ℃條件下無(wú)孢子囊萌發(fā)，4～25 ℃范圍內(nèi)孢子囊均可萌發(fā)，但4 ℃條件下前9 h無(wú)孢子囊萌發(fā)。孢子囊萌發(fā)率隨溫度升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，18 ℃ 時(shí)達(dá)最大值（表2）。溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)降低孢子囊萌發(fā)能力。

2.3相對(duì)濕度對(duì)烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)的影響

孢子囊在相對(duì)濕度98%～100%范圍內(nèi)可萌發(fā)，相對(duì)濕度≤95%時(shí)，孢子囊不萌發(fā)，且相對(duì)濕度98%與相對(duì)濕度100%條件下孢子囊萌發(fā)率差異較大。在供試相對(duì)濕度范圍內(nèi)，相對(duì)濕度為100%條件下孢子囊萌發(fā)率最高。但對(duì)照組蒸餾水條件下孢子囊萌發(fā)率高于供試組（表3）。

2.4pH值對(duì)烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)的影響

pH值5.74～8.06范圍內(nèi)烏頭霜霉病病原菌孢子囊均可萌發(fā)，在pH值為5.93時(shí)孢子囊萌發(fā)率最高（表4）。

2.5碳源對(duì)烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)的影響

在4種供試碳源處理下，烏頭霜霉病病原菌孢子囊均可萌發(fā)，且以可溶性淀粉作為碳源時(shí)孢子囊萌發(fā)率最高（表5）。

2.6烏頭霜霉菌致病力

形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，接種2 d后，葉背面初現(xiàn)水漬狀病斑，病斑新增速度較快，對(duì)照組接種點(diǎn)2 d沒(méi)有病斑顯現(xiàn)。接種2.5 d后，可看到明顯病斑，呈彌散型。病斑于7 d后增長(zhǎng)速度減緩，且葉背開(kāi)始?jí)乃溃瑝乃啦“叱首睾稚?。?duì)照組開(kāi)始?jí)乃罆r(shí)間與試驗(yàn)組相差不大。由圖2可知，觀察期內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，病情指數(shù)顯著增長(zhǎng)，從0增長(zhǎng)至77.8%。接種7 d后，孢子囊大量萌發(fā);接種10 d后，葉片開(kāi)始腐爛。

3結(jié)論與討論

余永年于1979年首次對(duì)烏頭霜霉病進(jìn)行報(bào)道，首次發(fā)現(xiàn)致病菌為霜霉屬新種烏頭霜霉（P. aconiti Yu）?并于1984年補(bǔ)充了對(duì)烏頭霜霉卵孢子的描述[2]，此后未見(jiàn)烏頭霜霉相關(guān)研究報(bào)道。筆者所在課題組歐洪根據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)特征以及rDNA-ITS區(qū)序列2個(gè)方面對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定，明確了病原菌的分類地位;同時(shí)初步研究了烏頭霜霉病的傳播機(jī)制，并建立了快速分子檢測(cè)病原菌的方法[3]。李娜等以四川省江油地區(qū)栽培烏頭為研究對(duì)象，探索了烏頭葉面微生物菌群動(dòng)態(tài)變化特征及其與烏頭霜霉病的相關(guān)性[10]。江油地區(qū)的藥農(nóng)目前多用多菌靈防治烏頭霜霉病，但效果甚微。關(guān)于烏頭霜霉病病原菌生物學(xué)特性的研究鮮有報(bào)道?；诖耍驹囼?yàn)在筆者所在課題組前期鑒定烏頭霜霉病病原菌為烏頭霜霉的基礎(chǔ)上，就不同溫度、pH值、相對(duì)濕度、碳源等環(huán)境因素對(duì)烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)的影響進(jìn)行了對(duì)比分析。

霜霉目真菌主要通過(guò)在菌絲分化的或不分化的孢囊梗上產(chǎn)生孢子囊而進(jìn)行無(wú)性繁殖，孢子囊萌發(fā)產(chǎn)生游動(dòng)孢子或直接產(chǎn)生芽管，然后發(fā)育成菌絲，霜霉屬卵菌的孢子囊萌發(fā)方式為直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管[12]，單軸霉屬的葡萄霜霉以產(chǎn)生游動(dòng)孢子的方式萌發(fā)[13]。本試驗(yàn)觀察到烏頭霜霉僅以孢子囊形成芽管的方式萌發(fā)，未見(jiàn)游動(dòng)孢子釋放。在崔鐵軍等的研究中，寄生霜霉孢子囊萌發(fā)除了以產(chǎn)生芽管的方式外還可以通過(guò)形成孢囊梗產(chǎn)生次生孢子囊[5]。烏頭霜霉與寄生霜霉同為于卵菌門(mén)（Oomycota）霜霉目（Peronosporales）霜霉科（Peronosporaceae）霜霉屬（Peronospora）。但在本試驗(yàn)中，未見(jiàn)次生孢子囊。

初步研究表明，在供試溫度條件范圍內(nèi)，孢子囊在4～25 ℃ 范圍內(nèi)均可萌發(fā)，但4 ℃條件下孢子囊萌發(fā)率較低且前9 h無(wú)孢子囊萌發(fā)，0 ℃時(shí)孢子囊無(wú)萌發(fā)力，孢子囊萌發(fā)的最適溫度為18 ℃。江油地區(qū)的烏頭霜霉病多暴發(fā)于3—4月，這與烏頭霜霉病病原菌萌發(fā)的最適溫度很可能有關(guān)。李金花等在罌粟霜霉病病原菌及其生物學(xué)特性研究中表明，孢子囊在最適溫度16 ℃條件下培養(yǎng)24 h，萌發(fā)率為58.5%[7]。在王艷等對(duì)菘藍(lán)霜霉病病原菌生物學(xué)特性研究中，霜霉菌孢子囊在最適溫度16 ℃條件下培養(yǎng)24 h，萌發(fā)率為3400%[13]。本試驗(yàn)結(jié)果與之相比明顯偏低，這可能是病原菌寄主不同所導(dǎo)致的。

在供試pH值條件下，孢子囊均可萌發(fā)，孢子囊萌發(fā)的最適pH值為5.93，試驗(yàn)表明弱酸性有利于烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)。劉紹芹對(duì)三裂葉豚草霜霉菌生物學(xué)特性研究顯示，在最適pH值8條件下的孢子囊培養(yǎng)12 h，萌發(fā)率為4330%[14]。本試驗(yàn)顯示，在最適pH值5.93條件下培養(yǎng)24 h，萌發(fā)率為7.25%，這可能與江油烏頭種植地區(qū)土壤酸堿性有關(guān)。這為烏頭霜霉病的防治提供了一條新的思路，也許可以通過(guò)調(diào)節(jié)烏頭種植的土壤pH值來(lái)降低烏頭霜霉病染病率。此外，在不同pH值的緩沖液中孢子囊萌發(fā)率都比在蒸餾水條件下的孢子囊萌發(fā)率低，這表明不同pH值的緩沖液都可以抑制孢子囊的萌發(fā)，對(duì)此有待進(jìn)行更深層次的研究。

在供試相對(duì)濕度范圍內(nèi)，孢子囊在相對(duì)濕度95%以下不能萌發(fā);相對(duì)濕度98%時(shí)孢子囊萌發(fā)率較低，且前10 h無(wú)孢子囊萌發(fā)，至24 h孢子囊萌發(fā)率僅為1.00%;相對(duì)濕度100%時(shí)孢子囊萌發(fā)率達(dá)到最大值，36 h孢子囊萌發(fā)率為11.50%;蒸餾水條件下孢子囊36 h萌發(fā)率則達(dá)到了14.00%，表明水分為孢子囊萌發(fā)的必需條件。而江油地區(qū)3—5月是感染傳播霜霉病的高發(fā)時(shí)節(jié)，且多雨。在王艷等所做的菘藍(lán)霜霉病原菌及其生物學(xué)特性研究中，相對(duì)濕度100%條件下孢子囊36 h萌發(fā)率為3.20%，蒸餾水中孢子囊36 h萌發(fā)率為18.33%[13]，本試驗(yàn)與其結(jié)果相近。

在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘油這4種供試碳源中，可溶性淀粉培養(yǎng)條件最適合孢子囊萌發(fā)，該條件下培養(yǎng)24 h萌發(fā)率為9.00%。在劉旭等對(duì)不同地區(qū)葡萄霜霉病病菌生物學(xué)特性研究中，重慶地區(qū)的葡萄霜霉菌在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖這3種碳源條件下培養(yǎng)24 h，孢子囊萌發(fā)率分別為6252%、56.17%、62.16%，陜西地區(qū)的葡萄霜霉菌在這3種碳源條件下培養(yǎng)24 h，孢子囊萌發(fā)率分別為43.75%、3831%、49.47%[15]。不同地區(qū)的同一種霜霉菌在相同條件下的孢子囊萌發(fā)率具有明顯差異，土壤營(yíng)養(yǎng)成分可能也是影響孢子囊萌發(fā)率的主要因素之一。

孢子囊懸浮液接種1 d后，葉片表面未觀察到病斑的形成，病情指數(shù)仍然為0，接種2 d后葉背開(kāi)始出現(xiàn)水漬狀病斑，同時(shí)病情指數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)為11.1%，這與司勝偉觀察的黃瓜霜霉病病情指數(shù)較為接近[16]。之后病斑擴(kuò)散速度較快，病情指數(shù)也隨之增加。接種7 d后病情指數(shù)增長(zhǎng)速度放緩，壞死病斑也開(kāi)始出現(xiàn)，但壞死病斑出現(xiàn)時(shí)間與李佩芳觀察到的時(shí)間[17]有所出入。

綜上，在離體條件下孢子囊萌發(fā)率均較低，但在烏頭葉片上接種孢子囊懸浮液后，觀察到葉片上的孢子囊?guī)缀跞慨a(chǎn)生芽管萌發(fā)，推測(cè)寄主選擇性是烏頭霜霉萌發(fā)的重要因素。與其他學(xué)者關(guān)于不同植物的霜霉病病原菌生物學(xué)特性研究結(jié)果相比，烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)率普遍偏低。如常永義等在全球紅葡萄霜霉病病菌生物學(xué)特性研究中，發(fā)現(xiàn)清水中培養(yǎng)24 h孢子囊萌發(fā)率高達(dá)89.25%[18]。在王艷等的研究中，與烏頭霜霉同為霜霉屬的菘藍(lán)霜霉在清水中最高萌發(fā)率也較低，為34%[13]。這可能與霜霉病病原菌的種屬來(lái)源、寄主以及不同霜霉菌萌發(fā)方式不同有關(guān)。鑒于烏頭霜霉菌專性寄生的特點(diǎn)，烏頭霜霉可能只在寄主烏頭葉片上大量萌發(fā)，離體情況下無(wú)法大量萌發(fā)。本研究明確了烏頭霜霉在不同環(huán)境條件下的生物學(xué)特性及其致病力，旨在為烏頭霜霉病的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，為該病的發(fā)生與防治提供理論依據(jù)。附子及川烏作為川產(chǎn)道地藥材，烏頭霜霉病的發(fā)生嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量和質(zhì)量，目前對(duì)該病害的發(fā)生和防治均未引起足夠重視。因此，須要盡快開(kāi)展針對(duì)該病害的抗病品種選育工作，從源頭保證烏頭植株的健康，同時(shí)還應(yīng)該篩選出高效防治藥劑，從而有效控制烏頭霜霉病的發(fā)生和蔓延。

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