趙鳳云 宋新華

摘要：用大麥苗分析單一硒（Se）、谷胱甘肽（GSH）和Se+GSH處理15 d對(duì)大麥苗富集Se與GSH及其抗氧化特性的影響。結(jié)果顯示，Se+GSH復(fù)合處理比單一Se或GSH處理增加了大麥苗對(duì)Se和GSH的積累量?？寡趸赶到y(tǒng)在Se+GSH復(fù)合處理與Se或GSH單一處理之間存在差異。Se+GSH復(fù)合處理的大麥苗過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的活性高于Se或GSH單一處理，相反，過(guò)氧化物酶（POD）活性則低于Se或GSH處理。Se+GSH處理超氧化物歧化酶（SOD）的活性比GSH處理低，而抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性則比GSH處理高。Se+GSH復(fù)合處理?xiàng)l件下谷胱甘肽還原酶（GR）的活性大于Se處理而小于GSH處理。Se+GSH處理的大麥苗丙二醛（MDA）含量無(wú)明顯變化，而總抗氧化能力（T-AOC）顯著提高。說(shuō)明Se+GSH復(fù)合作用比單一GSH或Se更有利于促進(jìn)GSH和Se的吸收與積累，同時(shí)增強(qiáng)抗氧化效果。

關(guān)鍵詞：硒;谷胱甘肽;復(fù)合作用;大麥苗;抗氧化特性

中圖分類(lèi)號(hào)： S512.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0120-04

收稿日期：2018-08-23

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2015CL009）;山東省淄博市科技發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：2017ZBXC196）。

作者簡(jiǎn)介：趙鳳云（1963—），女，山東諸城人，博士，教授，主要從事植物生物學(xué)研究。E-mail：1795320202@qq.com。

大麥苗含有豐富的氨基酸、礦物質(zhì)、活性酶、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，具有良好的營(yíng)養(yǎng)和保健作用，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出大麥苗粉、大麥汁飲品、保健產(chǎn)品添加劑和大麥苗面類(lèi)食品等保健食品，特別是富硒大麥產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用對(duì)提高人體免疫、預(yù)防缺硒引起的各種疾病至關(guān)重要[1-2]。硒是一些抗氧化酶和硒蛋白的重要組成成分，具有多種生物活性功能，它不僅是人體和動(dòng)物必需的微量元素，而且對(duì)植物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆及抗氧化水平等都有重要的調(diào)節(jié)作用。對(duì)番茄、大蒜與胡蘿卜等植物的研究表明，適量的硒促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，但過(guò)量的硒則抑制生長(zhǎng)[3-5]。在水稻、蜈蚣草、番茄、鐵皮石斛和大麥等植物中研究發(fā)現(xiàn)，硒能提高還原型谷胱甘肽（GSH）與抗壞血酸（AsA）含量及抗氧化酶活性，減少過(guò)氧化氫（H2O2）的積累和丙二醛（MDA）的產(chǎn)生，緩解除草劑、重金屬、鹽和低溫對(duì)植物的傷害[6-10]。一定濃度范圍內(nèi)外源硒使谷子產(chǎn)量、谷胱甘肽（GSH）、可溶性糖和粗蛋白含量增加，并提高過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的活性[11-12]。GSH不僅是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑，也是人體抗衰老和增強(qiáng)免疫力不可缺少的活性分子，它是谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在氧化防御反應(yīng)、化合物代謝、核酸和蛋白質(zhì)等大分子的生物合成、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)間相互作用等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[13-14]。GSH作為細(xì)胞內(nèi)的重要還原劑，影響抗氧化系統(tǒng)中SOD、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）等多種酶的活性[14]。外源GSH影響植物抗氧化系統(tǒng)中保護(hù)酶的活性，改變內(nèi)源GSH和AsA的含量，參與植物細(xì)胞對(duì)重金屬、極端溫度、干旱、高鹽等逆境脅迫的應(yīng)答[15-16]。外源硒增加小麥、水稻、番茄等植物谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和GSH含量，影響谷胱甘肽氧化還原循環(huán)[6，8，10，17]。硒和GSH系統(tǒng)在增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力和預(yù)防過(guò)量自由基引起的疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-2，18]。關(guān)于硒和GSH對(duì)生物生理生化的影響已開(kāi)展了廣泛研究，但是對(duì)于這二者的復(fù)合作用則少見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在分析同時(shí)富集硒和GSH大麥苗生理生化特性的變化，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)富硒和GSH大麥苗功能食品奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與處理

大麥種子用75%乙醇（30 s）和次氯酸鈉（15 min）消毒，無(wú)菌水沖洗干凈，置于培養(yǎng)盤(pán)放培養(yǎng)箱內(nèi)26～28 ℃暗培養(yǎng)48 h，其間定時(shí)噴灑無(wú)菌水。然后將小苗移植到培養(yǎng)盆中（含滅菌的沙子，底部有濾網(wǎng)，外套無(wú)孔盆，便于換水），放在培養(yǎng)室[晝/夜相對(duì)濕度60%/80%，晝/夜溫度26 ℃/20 ℃，光照14 h，光照度200 μmol/（m2·s）]用霍格蘭（Hoagland）營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)3 d后開(kāi)始處理。在營(yíng)養(yǎng)液中分別或同時(shí)添加還原型谷胱甘肽（GSH）和亞硒酸鈉（Na2SeO3，Se），其中GSH每天遞增0.5 mmol/L，Se每天遞增0.1 μmol/L，直至最終濃度分別為GSH 3 mmol/L、Se 0.6 μmol/L，然后用終濃度培養(yǎng)15 d（每天換培養(yǎng)液），收割大麥苗用于測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。每種處理至少獨(dú)立重復(fù)3次，每次至少3個(gè)平行處理（約100株/盆）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1硒和GSH含量的測(cè)定

硒含量的測(cè)定依據(jù)GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》中電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）;GSH的提取和含量的測(cè)定參照Luwe等的方法[19]。

1.2.2酶液的提取及酶活性的測(cè)定

各種酶的提取參照Rao等的方法[20]，APX的提取液額外加入5 mmol/L抗壞血酸。APX和POD活性的測(cè)定參照Rao等的方法[20];脫氫抗壞血酸酶（DHAR）活性的測(cè)定按照Chen等的方法[21];CAT活性的測(cè)定參照Rao等的方法[22];SOD活性的測(cè)定參照Z(yǔ)hao等的方法[23];GR和GST活性的測(cè)定參照Gronwald等的方法[24]。

1.2.3MDA含量的測(cè)定

MDA含量的測(cè)定參照林植芳等的方法[25]。

1.2.4大麥苗粉總抗氧化能力（T-AOC）的測(cè)定

總抗氧化能力的測(cè)定按T-AOC測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將各種處理的大麥苗用液氮研磨成粉，取真空冷凍干燥前/干燥后相同質(zhì)量的大麥苗粉，按1 g ∶9 mL 的比例加入蒸餾水，冰水浴條件下制成勻漿液，4 247 r/min 離心10 min，用上清液測(cè)定。

以上試驗(yàn)于2018年3—7月在山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分子實(shí)驗(yàn)室和山東理工大學(xué)分析測(cè)試中心完成。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果用3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示。用t-檢驗(yàn)分析不同處理之間的差異，差異顯著水平用P<0.05或P<0.01表示。

2結(jié)果與分析

2.1Se+GSH復(fù)合處理對(duì)大麥苗GSH和Se含量的影響

如圖1-A所示，與對(duì)照比，單一GSH、Se+GSH處理的大麥苗GSH含量分別增加1.14、2.18倍，后者增加幅度大于前者，差異極顯著（P<0.01）。

如圖1-B所示，單一Se和Se+GSH處理的大麥苗Se含量分別比對(duì)照增加34.83%和72.02%，復(fù)合處理的Se含量比Se單一處理高27.57%（P<0.05）。

2.2Se+GSH復(fù)合處理對(duì)大麥苗抗氧化酶活性的影響

2.2.1Se+GSH復(fù)合處理對(duì)大麥苗SOD和CAT活性的影響

如圖2-A所示，與對(duì)照比，不同處理?xiàng)l件下大麥苗SOD活性都顯著降低（P<0.05）。其中，Se單一處理比對(duì)照低53.74%且與Se+GSH處理差異不顯著，但GSH單一處理的降低幅度小于Se和Se+GSH處理（P<0.05）。

如圖2-B所示，3種處理?xiàng)l件下的CAT活性都比對(duì)照有所提高（P<0.05），其中Se+GSH處理的大麥苗CAT活性增強(qiáng)程度最大，比對(duì)照高87.30%，比GSH單一處理高53.11%。

2.2.2Se+GSH復(fù)合處理對(duì)大麥苗APX和DHAR活性的影響

如圖3-A所示，3種處理?xiàng)l件下APX活性變化存在顯著差異，其中Se單一處理比對(duì)照高22.43%（P<0.05），GSH單一處理的APX活性比對(duì)照低40.52%（P<0.05），而Se+GSH 復(fù)合處理與對(duì)照差異不顯著。

如圖3-B所示，GSH單一處理的DHAR活性比對(duì)照增強(qiáng)11.26%（P<0.05），Se和Se+GSH處理的DHAR活性大小類(lèi)似，且均與對(duì)照差異不顯著。

2.2.3Se+GSH復(fù)合處理對(duì)大麥苗GST和GR活性的影響

如圖4-A所示，3種處理的大麥苗GST活性都比對(duì)照強(qiáng)，其中Se+GSH處理的增加幅度最大，分別比對(duì)照、單一Se和單一GSH處理高107.38%（P<0.01）、84.48%（P<0.05）和

37.24%（P<0.05）。

如圖4-B所示，3種處理?xiàng)l件下的大麥苗GR活性都比對(duì)照低，但是降低程度有差異，其中，單一GSH處理的降低幅度最小，比對(duì)照低22.24%（P<0.05），其次是 Se+GSH復(fù)合處理（P<0.05），單一Se處理的GR活性最低，比對(duì)照低6946%（P<0.01）。

2.2.4Se+GSH復(fù)合處理對(duì)大麥苗POD活性的影響

如圖5所示，與對(duì)照比，單一Se處理的POD活性略有增強(qiáng)，但差異不顯著，單一GSH和Se+GSH處理的POD活性都減弱，其中Se+GSH復(fù)合處理的減弱幅度最大，比對(duì)照減弱47.53%（P<0.05）。

2.3Se+GSH復(fù)合處理對(duì)大麥苗MDA含量的影響

如圖6所示，各處理組MDA含量與對(duì)照組之間差異不顯著。

2.4Se+GSH復(fù)合處理對(duì)大麥苗粉總抗氧化能力T-AOC的影響

為了進(jìn)一步分析Se+GSH復(fù)合處理大麥苗粉的抗氧化水平，分別測(cè)定真空冷凍干燥前后的大麥苗粉提取液總抗氧化能力T-AOC。如圖7所示，干燥前，對(duì)照和Se+GSH復(fù)合處理大麥苗粉的T-AOC分別為13.13、25.14 U/mL，后者的總抗氧化能力比前者高91.47%。真空冷凍干燥后，對(duì)照和Se+GSH復(fù)合處理的大麥苗粉的T-AOC都有所下降，與干燥前比，對(duì)照和復(fù)合處理的T-AOC分別降低21.48%和1679%，但復(fù)合處理的總抗氧化能力仍然比對(duì)照大1.03倍。

3討論與結(jié)論

硒在增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、預(yù)防缺硒和過(guò)量自由基引起的疾病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-2，18]。通過(guò)植物吸收將有毒的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的有機(jī)硒是提高人體攝取硒的重要途徑。植物對(duì)硒的吸收積累能力與植物種類(lèi)、發(fā)育時(shí)期、處理時(shí)間、處理方式、濃度及硒的價(jià)態(tài)等有關(guān)。對(duì)同一植物而言，在硒的價(jià)態(tài)和處理方式相同時(shí)，一定的時(shí)間和濃度范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加植物對(duì)硒的吸收積累也增加，但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高則會(huì)抑制植物生長(zhǎng)并減少對(duì)硒的吸收[26-29]。本試驗(yàn)中，萌發(fā)生長(zhǎng)5 d的大麥苗用0.6 μmol/L亞硒酸鈉處理15 d時(shí)對(duì)硒的吸收積累效果較好。張承東等的研究表明，硒能提高GSH含量，影響抗氧化酶活性，減少H2O2的積累和MDA的產(chǎn)生，進(jìn)而緩解逆境對(duì)植物的傷害[6-10]。GSH是谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，也是人體抗衰老和增強(qiáng)免疫力不可缺少的活性分子[13-14]。本試驗(yàn)中Se+GSH復(fù)合處理?xiàng)l件下，大麥苗Se和GSH的含量比單一Se或GSH處理都多，說(shuō)明Se+GSH復(fù)合作用促進(jìn)了Se和GSH的積累。Se和GSH都能增強(qiáng)生物體的抗氧化能力，減少過(guò)量自由基的產(chǎn)生。抗氧化酶系統(tǒng)是植物體內(nèi)清除自由基的重要途徑。本研究中，大麥苗幾個(gè)抗氧化酶的活性在Se+GSH 復(fù)合處理與單一Se或GSH處理之間存在差異。如Se+GSH處理SOD活性的減弱幅度大于單一GSH處理。就清除H2O2的抗氧化酶CAT、APX和POD而言，不同處理?xiàng)l件下其活性變化也不同，如Se+GSH處理的大麥苗CAT活性增強(qiáng)程度大于Se或GSH單一處理;Se+GSH復(fù)合處理的APX活性無(wú)顯著變化，而單一Se處理使APX活性增強(qiáng)，相反，單一GSH處理則使其活性減弱;Se+GSH復(fù)合處理的POD活性顯著弱于GSH或Se單一處理。GST和GR是谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的重要酶，本試驗(yàn)中Se+GSH處理的GST活性增強(qiáng)幅度顯著大于Se和GSH單一處理;無(wú)論是單一處理還是復(fù)合處理大麥苗GR的活性都減弱，但是單一GSH處理的減弱幅度小于單一Se和Se+GSH處理組的。本試驗(yàn)條件下，Se+GSH處理的大麥苗MDA含量無(wú)明顯變化，而總抗氧化能力顯著提高。這些結(jié)果說(shuō)明Se+GSH復(fù)合作用比單一GSH或Se更有利于促進(jìn)GSH和Se的吸收與積累，同時(shí)增強(qiáng)抗氧化效果。本研究為進(jìn)一步研發(fā)富集GSH和Se大麥苗功能營(yíng)養(yǎng)粉奠定了重要基礎(chǔ)。

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