黃 燕， 邱立朋， 朱夢琴， 宿丹丹， 陳敬華

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時形成的脂質(zhì)雙分子層閉合囊泡[1]，其各層之間被水相隔開，在水中平衡后具有親水性和疏水性兩性性質(zhì)，被作為藥物載體以控制藥物釋放，減少毒性，提高療效。阿霉素（Doxorubicin，DOX）是有效的抗腫瘤藥物之一，但其具有嚴(yán)重的心臟毒性等毒副作用[2]。通過脂質(zhì)體包裹阿霉素靜脈注射，能夠減少阿霉素的心臟分布，降低心臟毒性，提高抗腫瘤療效[3-4]。然而，普通脂質(zhì)體存在腫瘤靶向性不足的缺點，因此，通過生物材料對其表面進(jìn)行修飾是一種提高脂質(zhì)體靶向性和穩(wěn)定性，增強細(xì)胞內(nèi)吞能力，延長體內(nèi)循環(huán)作用時間的有效手段[5]。

透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）是一種廣泛存在于體內(nèi)各組織中的大分子鏈狀黏多糖[6]。HA結(jié)構(gòu)中有羧基、羥基和酰胺鍵，使其利于載體材料的修飾。研究表明，細(xì)胞表面CD44、RHAMM、LYVE-1和HARE等是HA的四類特異性受體[7]。其中，CD44是細(xì)胞表面最重要的HA受體[8]。與正常細(xì)胞相比，CD44受體在乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)[9]。根據(jù)受體-配體理論，HA作為抗腫瘤藥物靶向載體時，能與腫瘤細(xì)胞表面的CD44受體特異性結(jié)合，使更多的抗腫瘤藥物分子靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，提高抗腫瘤藥物的藥物療效[10-12]。

因此，為提高脂質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)吞能力及主動靶向性，延長循環(huán)時間，并增大疏水性藥物攜載能力，作者制備了HA修飾的DOX脂質(zhì)體。通過HA與十八烷胺（Octadecylamine，OA）進(jìn)行反應(yīng)透明質(zhì)酸-十八烷基（Hyaluronic acid-Octodecane，HOA）聚合物，然后通過后插入法制備HOA修飾的DOX靶向脂質(zhì)體（DOX/LP/HOA），并對其物理化學(xué)性質(zhì)及體外抑制腫瘤細(xì)胞生長活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 HA（相對分子質(zhì)量5 300）：購自華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司；大豆磷脂（純度98%）：購于上海太偉有限公司；膽固醇：購于上海生工生物工程股份有限公司；十八烷胺、N-羥基琥珀酰亞胺 （NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）：購于上海晶純生化科技股份有限公司；三乙胺（TEA）、甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺酰胺（DMF）、二氯甲烷（CH2Cl2）二胺四乙酸二鈉（EDTA）：購自購自國藥集團化學(xué)試劑公司。反應(yīng)用的溶劑使用前均需重蒸純化。

1.1.2 儀器 RV10BS96旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA儀器設(shè)備有限公司制造；DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司制造；AVANCEⅢ型核磁共振儀：瑞士Bruker公司制造；UV-1800型紫外分光光度計：日本島津儀器有限公司制造；FreeZone冷凍干燥儀：美國Labconco公司制造；Zetasizer Nano ZS納米粒度分析儀：英國Malven公司制造；JY92-ⅡN型超聲波細(xì)胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司制造；JEM-2100型透射電子顯微鏡：日本Jeol公司制造；Multiskan Go型酶標(biāo)儀：美國Thermo公司制造。

1.1.3 細(xì)胞 MCF-7細(xì)胞：購自中國科學(xué)院保藏中心（上海）。

1.2 HOA的合成及結(jié)構(gòu)確證

精確稱取HA 100 mg溶于10 mL無水甲酰胺中，加入100 mg EDC和60 mg NHS，冰浴下磁力攪拌2 h。稱取72 mg OA胺溶于5 mL無水DMF，將其緩慢滴入上述HA混合液中，30℃氮氣環(huán)境下攪拌反應(yīng)40 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液裝入透析袋（截留相對分子質(zhì)量3 500）中，于過量的水/乙醇混合液（1/3~1/1）中依次透析1 d，去離子水中透析2 d，0.45 μm水系濾膜過濾后，冷凍干燥得白色HOA聚合物[13-14]，用核磁共振波譜（1H NMR）確定其結(jié)構(gòu)。

1.3 脂質(zhì)體制備

1.3.1 阿霉素堿基的制備 精密稱量30 mg鹽酸阿霉素，將其溶于30 mL甲醇溶液中，加入30 μL三乙胺，室溫下避光攪拌過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑后，再加入四氫呋喃復(fù)溶，得到1 mg/mL的阿霉素堿基溶液，避光保存。

1.3.2 脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法制備載DOX普通脂質(zhì)體 （DOX/LP）。精確稱取大豆磷脂400 mg，膽固醇50 mg，加入10 mL無水乙醚使其溶解后，置于500 mL的圓底燒瓶中。精密量取2 mL含DOX的四氫呋喃溶液，緩慢滴加至上述溶液中，80 r/min條件下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)，除盡有機溶劑，脂質(zhì)則均勻地分布在圓底燒瓶內(nèi)表面。加入10 mL磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS，pH 7.4）振搖，水化 30 min，使脂質(zhì)膜充分水合溶脹，得均勻白色混懸液。然后將所得到的初脂質(zhì)體再冰浴超聲10 min（超聲功率400 W，工作5 s，間歇5 s），離心5 min，除去未載入的藥物，即得DOX/LP。

采用后插入法制備HA修飾的靶向脂質(zhì)體（DOX/LP/HOA）[15]。取適量 HOA膠束溶液滴入DOX/LP中，50℃下恒溫孵育2 h，冷卻后得（DOX/LP/HOA）。

1.4 粒徑、zeta電位及形貌表征

取適量脂質(zhì)體溶液于測量杯內(nèi)，通過Malven納米粒度分析儀測定脂質(zhì)體的粒徑、粒徑分布及zeta電位值。

將上述脂質(zhì)體溶液混合均勻后，滴至覆有支持膜的銅網(wǎng)上，待液體揮干后用2%磷鎢酸鈉負(fù)染，室溫干燥，用透射電鏡（TEM）觀察其外貌形態(tài)。

1.5 包封率的測定

1.5.1 檢測波長的選擇 分別取空白HOA修飾的脂質(zhì)體和DOX溶液，稀釋至一定濃度，用紫外分光光度計在200~700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，確定DOX的檢測波長。

1.5.2 DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 精確稱取阿霉素10 mg，置于容量瓶中，用純水溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL的母液。精密量取適量DOX母液置于10 mL的棕色容量瓶中，純水稀釋定容得到1、2、8、12、16、32、40 μg/mL 的系列 DOX 標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用紫外分光光度計測定阿霉素的紫外吸收值，以吸光度A對DOX的質(zhì)量濃度c作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 精密度的測定 按照上述方法分別配制2、12 μg/mL 和 32 μg/mL 的低、中、高質(zhì)量濃度待測溶液，在同一天的內(nèi)測定5次，計算日內(nèi)精密度，并連續(xù)測5天計算日間精密度。

1.5.4 回收率的測定 取0.5 mL空白脂質(zhì)體溶液，加入阿霉素儲備液適量，稀釋至質(zhì)量濃度分別2、12、32 μg/mL 的低、中、高質(zhì)量濃度待測溶液，測定吸光度，并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算回收率。

1.5.5 包封率的測定 采用超速離心法測定包封率[16]。精確量取1.5 mL脂質(zhì)體于截留相對分子質(zhì)量為3 000的超濾杯中，10 000 r/min離心30 min，測定濾出液吸光度，計算得到藥物的包封率（EE）。

1.6 體外釋放

采用動態(tài)透析法考察載藥脂質(zhì)體的體外釋放行為。取2 mL DOX/LP和DOX/LP/HOA置于透析袋內(nèi)（截留相對分子質(zhì)量為3 500），封口后投入裝有10 mL、pH 7.4的PBS釋放介質(zhì)的棕色瓶中，于（37±0.5）℃、100 r/min避光振搖。 分別于不同時間點取樣1 mL，同時補充相同體積和溫度的新鮮PBS。利用紫外分光光度法測定樣品的吸光度值，計算累積釋放百分?jǐn)?shù)。

1.7 抑制腫瘤細(xì)胞生長活性評價

取處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，以6×103個/孔接種于96孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，分別加入 100 μL 的游離 DOX、DOX/LP、 DOX/LP/HOA溶液，同時設(shè)空白對照組。孵育48 h后，吸去含藥培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的MTT溶液（0.5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。然后每孔加入100 μL的DMSO用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度值（OD），并計算細(xì)胞存活率，評價其抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 HOA合成及表征

利用十八烷胺上的氨基與HA結(jié)構(gòu)中的羧基進(jìn)行反應(yīng)，制備HOA聚合物，合成過程見圖1。通過1H-NMR譜圖對HOA聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證見圖2。其中，1.95 μg/g為HA結(jié)構(gòu)中乙酰甲基的特征峰，0.83 μg/g和1.23 μg/g處出現(xiàn)新的特征峰，為十八烷基長鏈中甲基和亞甲基的特征峰，這表明成功合成了HOA聚合物。

圖1 HOA的合成路線圖Fig.1 Synthesis route of HOA conjugate

圖2HOA和HA的1H-NMR譜圖Fig.2 1H-NMR spectra of HOA and HA

2.2 粒徑及zeta電位

DOX/LP和DOX/LP/HOA的粒徑、多分散指數(shù)及zeta電位值見表1?？梢钥闯?，制備得到的脂質(zhì)體粒徑較小，經(jīng)HOA修飾后，脂質(zhì)體粒徑及PDI值無明顯變化，zeta電位有所下降。DOX/LP/HOA負(fù)的zeta電位能夠有效防止粒子聚集，增加脂質(zhì)體穩(wěn)定性，同時可以避免血漿蛋白的吸附，提高在血液中的循環(huán)穩(wěn)定性。此外，圖3顯示DOX/LP/HOA脂質(zhì)體粒徑分布較窄，形貌為球形或類球形。

表1 不同脂質(zhì)體的粒徑、多分散指數(shù)及zeta電位值（n=3）Table 1 Sizes，PDI andzeta potential of different liposomes（n=3）

圖3 DOX/LP/HOA粒徑分布圖及透射電鏡圖Fig.3 Size distribution and TEM micrograph of DOX/LP/HOA

2.3 載藥量測定

2.3.1 阿霉素吸收波長 用紫外分光光度法對空白脂質(zhì)體和DOX溶液的全波長進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖4。DOX在480 nm處有最大吸收峰，而空白脂質(zhì)體在此波長并無吸收，不干擾藥物質(zhì)量濃度測定，故選擇紫外分光光度計作為DOX質(zhì)量濃度的檢測方法，檢測波長為480 nm。

圖4 空白脂質(zhì)體和DOX的紫外全波長掃描圖譜Fig.4 UV-scanning spectrometry of blank liposomes and DOX

2.3.2 阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線 以吸光度（A）對阿霉素質(zhì)量濃度（c）作圖，得到DOX回歸方程為：A=0.018 5c-0.001 5（r=0.999 7），結(jié)果表明阿霉素在 1~40 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性相關(guān)性，可用于DOX的定量分析。

2.3.3 精密度 質(zhì)量濃度為 2、12、32 μg/mL的阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果見表2。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好，各個質(zhì)量濃度的精密度RSD值均小于2%，符合方法學(xué)要求。

2.3.4 回收率 質(zhì)量濃度為 2、12、32 μg/mL的阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均回收率分別為100.24%、99.14%和98.95%，RSD值在0.67~1.53，說明該方法的回收率良好。

表2 阿霉素精密度的測定（n=5）Table 2 Precision determination of DOX（n=5）

2.4 包封率

通過超速離心法測定DOX/LP包封率為（95.4±0.32）%，DOX/LP/HOA 的包封率為 （98.85±0.40）%。經(jīng)HOA聚合物修飾后，脂質(zhì)體的疏水性空間增大，對DOX具有較好的親和力，因此，DOX/LP/HOA的包封率有所提高。

2.5 體外釋放實驗

采用動態(tài)透析法考察DOX/LP和DOX/LP/HOA脂質(zhì)體的體外釋放行為，結(jié)果見圖5。脂質(zhì)體釋放初期均無明顯的突釋效應(yīng)，表明DOX被全部包載于脂質(zhì)體雙層中，這與測定的較高包封率結(jié)果一致。隨著時間的延長，脂質(zhì)體均緩慢釋放，DOX/LP和DOX/LP/HOA的72 h累計釋放百分率分別為32.8%和23.16%，具有明顯的緩釋效果。此外，由圖5可以看出，DOX/LP/HOA的釋放更緩慢，這可能是因為HOA的疏水段十八烷基插入脂質(zhì)體雙分子層膜，導(dǎo)致疏水作用力增強，形成的空隙更小，不利于藥物向外自由擴散。

圖5DOX/LP/HOA和DOX/LP體外釋放圖（n=3）Fig.5 In vitro drug release profiles of DOX/LP/HOA and DOX/LP（n=3）

2.6 細(xì)胞毒性研究

MTT 法測定 的 游 離 DOX、DOX/LP、DOX/LP/HOA的細(xì)胞毒性見圖6。結(jié)果表明，隨著DOX質(zhì)量濃度增加，不同組的MCF-7細(xì)胞存活率逐漸降低，這表明細(xì)胞毒性具有濃度依賴性。此外，DOX/LP、DOX/LP/HOA和游離DOX的細(xì)胞半數(shù)抑制質(zhì)量濃度 （IC50） 分別為 （2.241±0.351）、（1.458±0.164）、（0.611±0.350） mg/L。 DOX/LP、DOX/LP/HOA、DOX的IC50依次變小，其抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性越好，說明DOX的脂質(zhì)體劑型（DOX/LP）更容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞；用HA進(jìn)一步修飾其脂質(zhì)體劑型得到DOX/LP/HOA，DOX/LP/HOA可以通過CD44受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用高效進(jìn)入細(xì)胞，從而達(dá)到更好地抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性。

圖6DOX/LP、DOX/LP/HOA與游離DOX對 MCF-7細(xì)胞生長的抑制活性（n=3）Fig.6 In vitro cytotoxicity of DOX/LP、DOX/LP/HOA and free DOX against MCF-7 cells（n=3）

3 結(jié)語

脂質(zhì)體作為藥物載體因其主要由天然磷脂和膽固醇組成，具有良好的生物相容性，不會在體內(nèi)積累，免疫原性小、無毒副作用等優(yōu)點受到越來越多人的重視。并且，根據(jù)臨床治療的目的，可以改變脂質(zhì)體的成分提高脂質(zhì)體的靶向性。阿霉素是臨床上常用的蒽環(huán)類抗惡性腫瘤藥物，抗癌譜廣，療效好，但是其沒有選擇性，易導(dǎo)致骨髓抑制、胃腸道毒性以及心臟毒性等副作用，因此我們利用HA具有修飾方便、生物相容性以及受體靶向性等優(yōu)點，制備了靶向性DOX/LP/HOA脂質(zhì)體，增大對疏水性藥物的攜載能力，控制藥物緩慢釋放，提高藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制活性。