栗連會 ， 肖 辰 ， 陸震鳴 ， 張曉娟 ，王松濤， 沈才洪， 史勁松， 許正宏*，5

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；4.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000；5.中國科學院 天津工業(yè)生物技術研究所，天津300308）

瀘型酒是占中國白酒年產量70%以上的重要酒種[1]，產品具有“窖香濃郁，綿軟甘冽，香味諧調，尾凈余長”的風味特征。瀘型酒的生產采用大曲為糖化發(fā)酵劑，并通過固態(tài)發(fā)酵工藝產生豐富的白酒風味物質，包括酵母、霉菌、乳酸菌、芽孢桿菌、己酸菌、丁酸菌、硫酸鹽還原菌和古菌在內的多種微生物類群[2-7]參與了風味物質的合成。

研究表明，乳酸菌在瀘型酒釀造大曲、酒醅、窖泥等生產環(huán)境中廣泛存在，是重要的微生物類群[8-9]。候小歌[10]等人從大曲中分離到乳桿菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬和微球菌屬共4個屬8種乳酸菌，劉麗萌[11]等人從酒醅中分離得到9種片球菌，其中包括酒窖片球菌和耐乙醇片球菌兩個新種。張文學[12]等人通過 PCR-DGGE技術發(fā)現(xiàn)Lactobacillus acetotolerans在發(fā)酵一周后成為酒醅中的優(yōu)勢微生物，并保持至發(fā)酵結束。吳莉莉[13]等人對醬香型和清香型白酒發(fā)酵過程中乳酸菌菌群結構進行了比較，發(fā)現(xiàn)其菌群組成呈現(xiàn)出明顯差異。然而，對于瀘型酒釀造過程中酒醅乳酸菌的來源、演替規(guī)律及潛在功能目前尚缺少系統(tǒng)研究。

作者采用16S rRNA基因高通量測序技術，分析和比較了大曲、酒醅與窖泥中乳酸菌群落組成差異，以期明確酒醅中乳酸菌的主要來源；然后解析了乳酸菌群落在發(fā)酵酒醅中的演替規(guī)律，并利用PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）分析對乳酸菌在發(fā)酵過程中的潛在功能進行了預測，為深入探索乳酸菌在白酒釀造過程中的作用與影響提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品

酒醅、窖泥、大曲樣品：取自四川瀘州老窖釀造基地的同一個生產窖池。其中酒醅樣品為發(fā)酵過程中第 0、1、2、3、7、11、20、30、40 天所取。 每天取 3 個平行樣充分混合，取樣后迅速置于-80℃保藏。

1.2 試劑與儀器

PowerSoil DNA提取試劑盒：美國MO BIO公司；引物：由上海生工生物工程有限公司合成；Genome Sequencer FLX Titanium system：瑞士Roche公司；NanoDrop 3000：美國 Thermo Fisher Scientific公司；其它分析純試劑：購自國藥集團。

1.3 DNA提取

采用PowerSoil DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，然后用NanoDrop測定其濃度和純度，保證每個樣品的DNA量大于5 μg，純度滿足A260/A280值在1.8~2.0之間。

1.4 細菌16S rRNA基因擴增和高通量測序

高通量測序采用針對細菌16S rRNA基因V1-V3 高變區(qū)域（Escherichia colipositions 5-534）的通用引物 P1 （5’-NNNNNNN-TGGAGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3’）和 P2（5’-NNNNNNN-TACCGCGG CTGCTGGCAC-3’）[14]，在每對引物的 5’末端添加了18個不同的堿基序列以區(qū)分不同樣品擴增得到的序列。PCR擴增采用GoTaq Hot Start Polymerase mix（Promega，USA），具體反應程序如下：95 ℃預變性 2 min；94℃變性 30 s，56℃退火 25 s，72℃延伸25 s，共25個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產物經過純化回收并定量后，使用GS-FLX Titanium系統(tǒng)進行測序，產生平均讀長為400 bp的序列。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

原始序列根據(jù)不同的引物標簽劃分樣品，并去除以下不合格的序列[14]：長度小于150 bp；平均測序質量的分數(shù)小于35分；含有不明確的堿基對；含有8個以上單聚體或者不含引物的序列，同時采用UCHIME去除嵌合體[15]，得到有效的序列文件。

采 用 UCLUST 軟 件 （http：//www.drive5.com/uclust/）對所有序列的可操作單元（operational taxonomic unit，OTU）劃分，閾值設定為97%。利用Mothur軟件的classify.seqs命令，設定閾值為80%[16]，采用Greengenes數(shù)據(jù)庫得到OTU的分類學信息。

1.6 PICRUSt功能預測

參考 KEGG數(shù)據(jù)庫，采用 PICRUSt（http：//picrust.github.com/）工具對導入的OTU分類信息文件進行在線功能預測。

2 結果與分析

2.1 瀘型酒發(fā)酵過程中乳酸菌相對豐度變化趨勢

如圖1所示，在瀘型酒發(fā)酵過程中，乳酸菌在總細菌中所占的相對豐度呈現(xiàn)先急劇下降、然后逐漸上升的趨勢。在發(fā)酵的第0天（即入窖當天），乳酸菌的相對豐度大于50%（51.7%），是酒醅中最主要的微生物類群。封窖1 d后乳酸菌的相對豐度急劇下降至11.2%，說明大量乳酸菌不能適應急劇改變的酒醅環(huán)境而消亡。在發(fā)酵過程的1~7 d，酒醅中的乳酸菌快速繁殖，其相對豐度急劇上升；發(fā)酵7 d之后乳酸菌的相對豐度呈現(xiàn)緩慢上升，在發(fā)酵結束時達到78.8%，為發(fā)酵酒醅中的優(yōu)勢微生物。

圖1 瀘型酒發(fā)酵過程中乳酸菌相對豐度變化Fig.1 Changes of relative abundance of LAB during the fermentation process of Luzhou-flavor liquor

2.2 大曲、酒醅和窖泥中乳酸菌群落結構比較分析

白酒生產過程中大量的乳酸菌可能來源于生產過程的各個環(huán)節(jié)，并進入酒醅參與發(fā)酵。其中，大曲和泥窖分別作為發(fā)酵劑和釀造容器，在窖池內與酒醅直接接觸并發(fā)生微生物、物質和能量的交換，可能為酒醅提供豐富的微生物來源。因此，我們通過對成熟大曲、酒醅和窖泥的乳酸菌群落中乳酸菌群落結構的比較分析，討論酒醅中不同乳酸菌的可能來源。

高通量測序結果顯示在大曲、酒醅和窖泥中分別檢測到19、49和3種乳酸菌，見圖2。通過比較分析，我們發(fā)現(xiàn)有16種乳酸菌在大曲和酒醅中同時存在，其中有8種為酒醅中優(yōu)勢乳酸菌（相對豐度>0.1% ）， 分 別 是Lactobacillus brevis，Lactobacillus crustorum，Lactobacillus curvatus，Lactobacillus pentosus，Lactococcuslactis，Leuconostoccitreum，Weissella confusa和Weissella cibaria。同時，窖泥中的3種乳酸菌均在酒醅中檢測到，其中Lactobacillus acetotolerans在酒醅中是優(yōu)勢乳酸菌。酒醅中另有30種乳酸菌未能在大曲和窖泥中檢測到，可能來源于空氣等釀造環(huán)境，有待進一步研究。

圖2 大曲、酒醅與窖泥中的乳酸菌群落比較分析Fig.2 Comparison of LAB community among Daqu，fermented grains and pit mud

2.3 發(fā)酵過程酒醅中乳酸菌群落演替

如圖3所示，乳酸菌群落結構在發(fā)酵的第一周變化明顯，之后趨于穩(wěn)定。在入窖當天（第0天），Weissella confusa是優(yōu)勢乳酸菌，在乳酸菌群落中相對豐度達到88.0%，但在發(fā)酵開始之后其豐度急劇下降，直至在發(fā)酵結束時檢測不到。Lactobacillus fermentum在第0天時其豐度大于1%，隨后逐漸下降至無法檢測。與此相反，Lactobacillus acetotolerans的相對豐度在入窖時小于1%，之后開始迅速繁殖，并在發(fā)酵2 d后成為酒醅中的優(yōu)勢乳酸菌 （相對豐度>98%）。另有8種乳酸菌的相對豐度在發(fā)酵的第1天達到最大值，其分別為Lactobacillus brevis（2.7% ），Lactobacilluscrustorum（14.7% ），Lactobacillus curvatus（2.7%），Lactobacillus pentosus（4.2% ），Lactococcus garvieae（7.1% ），Leuconostoc citreum（7.1%），Pediococcus pentosaceus（4.2%）和Weissella cibaria（7.6%）；另有3種乳酸菌在發(fā)酵的第2天達到其最大豐度，其分別為Lactobacillus acidipiscis（2.2% ），Lactobacillusparacollinoides（1.8%），Lactococcus lactis（2.2%）。 在瀘型酒發(fā)酵過程中，這些乳酸菌物種不同的變化趨勢可能與其來源、生長代謝與環(huán)境耐受能力的多樣性相關。其中，封窖之后迅速形成的厭氧發(fā)酵環(huán)境可能是導致Weissella confusa快速消亡的原因；Lactobacillus acetotolerans可能由于其較強的耐酸、耐乙醇能力在發(fā)酵開始之后迅速成為優(yōu)勢乳酸菌[12]。

圖3 瀘型酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢乳酸菌種水平演替規(guī)律Fig.3 Dynamics of abundant LAB species during the fermentation process of Luzhou flavor liquor

2.4 乳酸菌群落功能預測

乳酸菌作為酒醅中的優(yōu)勢微生物類群，解析其在發(fā)酵過程中的潛在功能對于解析白酒釀造機理具有重要的意義。作者重點分析了乳酸菌群落在15個碳水化合物代謝途徑上的分布和演替規(guī)律。

如圖4所示，乳酸菌在酒醅發(fā)酵過程中參與最多的是糖酵解途徑，此外還涉及其它多種糖類的代謝，包括氨糖與核糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、果糖和甘露糖代謝和半乳糖代謝，然而其很少參與抗壞血酸代謝，五碳支鏈酸代謝與磷酸肌醇代謝。同時，風味物質中與丙酸、丁酸代謝相關的基因在預測的總基因數(shù)中也占有一定比例。從演替規(guī)律上看，大部分代謝途徑的預測基因數(shù)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，這與乳酸菌在總細菌中的相對豐度變化趨勢基本一致，說明其代謝功能與其豐度變化密切相關。而五碳支鏈酸代謝途徑預測基因數(shù)量則呈現(xiàn)出一直下降的趨勢，直至完全沒有。

圖4 乳酸菌群落在碳水化合物代謝途徑的功能預測Fig.4 Functional prediction ofLAB communityincarbohydrate metabolism pathway

3 結 語

通過高通量測序技術發(fā)現(xiàn)乳酸菌在總細菌中的相對豐度隨著發(fā)酵時間的推移逐漸上升，至發(fā)酵結束時成為優(yōu)勢微生物。這可能是由于窖池內厭氧、高濃度的有機酸和乙醇等特殊環(huán)境不適合大部分微生物的生存，而乳酸菌屬于兼性厭氧菌，且具有能夠耐受較低的pH等特性而使其成為優(yōu)勢微生物[17]。

通過比較瀘型酒生產過程中的大曲、酒醅和窖泥的乳酸菌群落結構，我們發(fā)現(xiàn)酒醅中的部分優(yōu)勢乳酸菌可以在大曲和窖泥中檢測到。大曲細菌群落以乳酸菌和芽孢桿菌為主體[18]，其作為糖化發(fā)酵劑以10%~20%的比例加入酒醅發(fā)酵，可以直接帶入大量乳酸菌。在之前的研究中，鄭佳等人[19]發(fā)現(xiàn)Lactobacillus acetotolerans是窖泥中的優(yōu)勢細菌，且窖池微生物可以通過酒醅與窖泥的接觸面相互遷移。因此，我們推斷酒醅中的部分優(yōu)勢乳酸菌來源于大曲，而優(yōu)勢乳酸菌Lactobacillus acetotolerans來源于窖泥。此外，酒醅中的其它乳酸菌可能來源于原輔料、空氣、水甚至操作人員等生產過程涉及的多種渠道。

通過對發(fā)酵酒醅中優(yōu)勢乳酸菌的演替規(guī)律分析，我們發(fā)現(xiàn)乳酸菌群落結構在發(fā)酵第一周劇烈變動，其物種多樣性隨著發(fā)酵時間的推移顯著降低。在發(fā)酵初期，Weissella confusa占主導地位，然而其很快被Lactobacillus acetotolerans所取代并一直保持至發(fā)酵結束，這與張文學等人的研究結果基本一致[12]。

此外，作者還采用PRICUSt技術對酒醅中乳酸菌群落進行了碳水化合物代謝相關途徑的功能預測，結果顯示，乳酸菌參與多種糖類物質的代謝，其中最主要的是糖酵解途徑，而在風味物質代謝中主要涉及丁酸、丙酸代謝。通過糖酵解途徑葡萄糖被降解為丙酮酸，并在厭氧條件下被還原為乳酸和乙醇，而乳酸正是乳酸菌最主要的代謝產物，這也在一定程度上解釋了乳酸菌更多的參與糖酵解途徑的原因。同時，多種乳酸菌也可以通過磷酸戊糖途徑進行異型乳酸發(fā)酵，但其乳酸合成效率僅為糖酵解途徑的一半。丁酸和丙酸是瀘型酒中的重要風味物質，被認為主要由梭狀芽孢桿菌屬、丙酸桿菌代謝產生[2]。本研究通過功能預測發(fā)現(xiàn)乳酸菌也有參與丁酸、丙酸代謝的潛力，而這些物質均是合成瀘型酒主體風味物質己酸乙酯的前體物，其是否具有進一步合成己酸乙酯的能力還需要進一步驗證。

綜上所述，本研究通過比較瀘型酒生產過程中大曲、酒醅和窖泥中的乳酸菌群落結構，初步了解了酒醅中部分乳酸菌的來源；同時解析了酒醅乳酸菌群落演替規(guī)律，并對乳酸菌群落功能進行了預測，為深入理解乳酸菌在瀘型酒釀造中的作用提供了研究基礎。