王 華 陳德文 周德強 曹丕宇

(1. 江蘇省食品先進制造裝備技術(shù)重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)機械工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3. 無損檢測技術(shù)教育部重點實驗室﹝南昌航空大學(xué)﹞，江西 南昌 330063；4. 國家日用小商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，浙江 義烏 322000 )

食品在生產(chǎn)或食用時不會對廣大群眾造成損害是食品安全的含義[1]。食品安全問題主要集中在化學(xué)性危害、生物毒素、微生物危害、食品攙假等多個方面。食品中存在金黃色葡萄球菌是世界性衛(wèi)生問題，跟據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心報告[2]，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，居全美第2位。金黃色葡萄球菌是引起食源性疾病發(fā)生率較高的5種病原菌之一，每年由金黃色葡萄球菌引起的食源性疾病病例達24萬例[3]。近年來，隨著抗生素的大量使用，金黃色葡萄球菌耐藥性越來越強，甚至出現(xiàn)了多重耐藥菌株和超級耐藥菌株，致病能力也日趨增強[4]。因此，檢測金黃色葡萄球菌具有較大的實際意義。目前，檢驗金黃色葡萄球菌的方法有常規(guī)細菌培養(yǎng)法[5-6]、免疫學(xué)方法[7]、分子生物學(xué)法[8-9]、質(zhì)譜分析[10]、生物傳感器檢測法[11]等。近幾年生物磁彈性傳感器的研究有較大的進展，相較于傳統(tǒng)方法目前很多學(xué)者利用磁彈性傳感器自身質(zhì)量變化而產(chǎn)生的共振頻移的特性，在磁彈性傳感器表面進行生物或者化學(xué)材料修飾，在其表面形成一層敏感薄膜，用以檢測各類細菌和各種有機物[12-14]。但現(xiàn)階段沒有學(xué)者利用質(zhì)量負載和傳感器所處溶液黏度的變化來實現(xiàn)對相同物質(zhì)的檢測。

本試驗擬利用磁彈性無線傳感器對金黃色葡萄球菌的檢測原理研究了黏度變化和質(zhì)量負載變化對傳感器的影響，并對比分析這2種方式的優(yōu)缺點，利用磁彈性傳感器的共振頻移檢測乳制品中是否含有金黃色葡萄球菌。

1 檢測原理

對于非晶合金帶材的磁彈性傳感器而言，其基頻共振頻率f0可由式(1)計算：

(1)

式中：

L——非金合金帶材的長度，mm；

E——非晶合金帶材的楊氏模量，GPa；

ρ——非晶合金帶材的密度，pg/mm3；

ν——非晶合金帶材的泊松比。

磁彈性傳感器在液體中的共振頻率受到多個因素的影響，其中主要受2個因素影響，一個是非晶合金帶材自身質(zhì)量；另一個是傳感器所處液體的黏度[15]。

當傳感器自身質(zhì)量發(fā)生變化時，根據(jù)式(2)可求得其變化后的共振頻率。

(2)

式中：

A——傳感器的面積，mm2；

d——傳感器的厚度，mm；

m——傳感器的重量，pg。

由于傳感器厚度變化相較與質(zhì)量變化所引起的頻移較小，可以忽略不計，從而可得：

(3)

對上式采用二項式展開，并忽略高于二次以上的項，可以得到：

(4)

當磁彈性傳感器被置入液體中時，由于液體黏度會產(chǎn)生一定的剪切力，會降低磁彈性傳感器的共振頻率。液體對磁彈性無線傳感器的共振頻率影響可以利用將磁彈性材料置入不可壓縮液體內(nèi)的振動理論模型進行分析計算。如圖1所示，當磁彈性材料被置于液體中時，可以假定傳感器的位置在2塊面積很大且相等的平板之間，并且假設(shè)磁彈性材料位于YZ平面上，與上下固定平板之間的距離都為h。

磁彈性材料在黏性液體中的運動方程為：

(5)

圖1 在液體中磁彈性材料的理論模型

式中：

ρ——膜片的密度，pg/mm3；

d——磁彈性傳感器的厚度，mm；

η——液體黏度，mPa·s；

κ——與滲透深度相關(guān)的系數(shù)[κ=(1+j)/δ]，mm-1；

h——2個固定平板之間距離的1/2，mm。

通過求解式(5)可以得到：

(6)

式中：

式(6)左邊是磁彈性傳感器在液體中共振基頻的平方項，右邊第一項為式(1)的平方，即磁彈性傳感器在空氣中的共振頻率的平方，等式右邊的第二項則是液體中剪切力的消散作用對磁彈性傳感器的影響。

當磁彈性傳感器處在高黏度溶液中時，即2h/δ<<1的液體而言，磁彈性傳感器的共振漂移可以表示為：

(7)

當磁彈性傳感器處在低黏度溶液中時，即2h/δ>>1，磁彈性傳感器的共振漂移則是：

(8)

2 試驗部分

2.1 試劑與設(shè)備

2.1.1 試劑

氨基化適配體：生工生物工程(上海)股份有限公司；

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：江南大學(xué)；

伊利鮮牛奶：市售；

丙烯酸：化學(xué)純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

二乙酸熒光素(FDA)：97%，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

胰蛋白胨、酵母粉：生物試劑，上海根生生物科技有限公司。

2.1.2 設(shè)備

數(shù)字顯示旋轉(zhuǎn)黏度計：NDJ-8S型，山東肥城佳貝爾儀器有限公司；

磁彈性傳感器的基體是鐵基非晶帶材：尺寸為3 mm×8 mm×25 μm，上海黃浦區(qū)健磁電子；

信號發(fā)生器：ET3325型，杭州中創(chuàng)電子有限公司；

壓力蒸汽滅菌器：XFS-280MF型手提式，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2D型，蘇州蘇杰凈化設(shè)備；

數(shù)據(jù)采集卡：DAQ2010型，凌華科技(中國)有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9015A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

熒光顯微鏡：Nikon 80i型正置，日本尼康株式會社；

自制TR型線圈：其中激勵線為400匝，檢測線圈為1 200匝，整個系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)框圖如圖2所示。

圖2 TR型線圈示意圖

2.2 試驗方法

2.2.1 傳感器的制備 采用的磁致伸縮傳感器的材料為鐵基非晶材料，將材料利用微切割技術(shù)剪裁成3 mm×8 mm的矩形薄片。先用乙醇將膜片清洗消毒后放入丙烯酸溶液中，密封1 h左右，待磁致伸縮膜片表面生成一層保護膜，防止磁致伸縮膜片生銹，為細菌提供一個生長場所，然后將膜片放置在超凈臺上通風(fēng)，并用紫外線照射殺菌30 min，取濃度為1 μL/mL適配體溶液30 μL滴在傳感器表面進行修飾，放在超凈臺上2 h使適配體固定在傳感器表面。

2.2.2 測量 由于TR型線圈是基于離心管繞制而成的，先將牛奶加入離心管中，并將修飾好的磁彈性帶材放入，然后使用掃頻的方法，首先利用間隔為1 kHz的激勵信號來確定共振點的大致頻率范圍，再在初次測取頻率信號前后1 kHz的范圍，進行間隔為100 Hz的小頻率掃描，從而確定最終共振點的頻率值。每隔1 h重復(fù)1次掃頻，但在進行人工污染后的試驗中，滴入金黃色葡萄球菌菌液30 min后增加了1組數(shù)據(jù)。由于數(shù)據(jù)采集可能存在誤差，因此在每個頻率點都采集5次數(shù)據(jù)，最終取5次的平均值作為每個頻率點的最終阻抗值。

2.2.3 熒光試驗 在頻率檢測試驗結(jié)束之前，先將6孔板培養(yǎng)24 h。待測量試驗結(jié)束時，先將浸入牛奶中的磁彈性生物傳感器用0.9%的NaCl溶液沖洗，將磁彈性傳感器從染菌的牛奶中取出并置于1個6孔板中，加入3 mL液體培養(yǎng)基和20 μL的FDA進行染色，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)15 min，在取FDA試劑時，將酒精燈點燃置于試劑瓶口15 cm內(nèi)。之后采用熒光顯微鏡拍攝樣品表面細菌熒光圖。同時，準備一個在未染菌牛奶中靜置的磁彈性傳感器做對比。整個試驗都需在超凈工作臺上進行。

2.2.4 黏度試驗 利用黏度計自身的水平儀調(diào)節(jié)黏度計處于水平，估計牛奶的黏度范圍選用合適的轉(zhuǎn)子，在調(diào)節(jié)旋動黏度計升降架時，緩慢調(diào)節(jié)黏度計，當轉(zhuǎn)子逐漸浸入樣品中，直至轉(zhuǎn)子上的標記與液面相平為止，使保護架、轉(zhuǎn)子處于容器中心。待轉(zhuǎn)子在樣品中浸泡3 min，使轉(zhuǎn)子溫度與樣品溫度一致。開始測量。當轉(zhuǎn)子在液體中旋轉(zhuǎn)20圈以上再讀取示數(shù)，每個試樣至少測量2次。在第1次測量完畢后，按“復(fù)位”鍵，直至轉(zhuǎn)子停止轉(zhuǎn)動后，再次啟動黏度計，開始第2次測量。測試結(jié)果取這2次測量結(jié)果的算術(shù)平均值。2次測量結(jié)果之差小于或等于2次測量結(jié)果平均值的10%，以保證測量的準確性，否則測量第3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 修飾后的膜片在無金黃色葡萄球菌的牛奶磁彈性傳感器檢測試驗

經(jīng)過25 h的測量，得到了如圖3所示的共振頻率關(guān)于時間的圖像。由圖3可知將傳感器放入牛奶中3 h內(nèi)膜片的共振頻率有很明顯的上升。經(jīng)過多次試驗都出現(xiàn)了這種現(xiàn)象，這與前文中理論分析并不相符，針對這個現(xiàn)象，推測該現(xiàn)象是磁彈性傳感器上的適配體沒能充分固定，在振動過程中從磁彈性傳感器上剝落，導(dǎo)致傳感器的自身質(zhì)量降低，使磁彈性無線傳感器的共振頻率上升。由于在這段時間內(nèi)牛奶的黏度一直保持在1.60 mPa·s，沒有出現(xiàn)變化，故排除因黏度變化造成的頻移。從圖3中可知，在經(jīng)過12 h試驗后，磁彈性傳感器的共振頻率發(fā)生了一些變化，由于此時試驗過程中磁彈性傳感器的位置發(fā)生了的變化，導(dǎo)致了磁彈性傳感器的共振頻率產(chǎn)生了一定的變化，當傳感器位置穩(wěn)定之后，頻率穩(wěn)定在76.9 kHz，在隨后的幾個小時并沒有再次測取，因為已經(jīng)證實3～11 h時在沒有外在影響因素的情況下，傳感器的共振頻率會在一個穩(wěn)定的頻率值，因此在隔了9 h后再次測取其共振頻率，測得仍為76.9 kHz。整個試驗中，共振頻率由原來的77 kHz變?yōu)榱?6.9 kHz，是因為磁彈性生物傳感器在離心管中的位置發(fā)生了變化。

圖3 磁彈性傳感器在未染菌的牛奶中的頻率響應(yīng)曲線

Figure 3 Frequency response curve of magnetoelastic sensor in milk withoutStaphylococcusaureus

為了進一步證實該牛奶中是否含有金黃色葡萄球菌，利用熒光試驗進行了驗證，圖4顯示傳感器上沒有任何異樣，證實了該牛奶是沒有金黃色葡萄球菌。

3.2 修飾后的膜片在含有金黃色葡萄球菌的牛奶中磁彈性傳感器檢測試驗

圖5顯示，在菌液滴入后的0.5 h內(nèi)，傳感器的共振頻率有很明顯的增大，該階段主要是由于磁彈性傳感器在離心管中位置發(fā)生了變化，在隨后的3 h內(nèi)，傳感器的共振頻率一直維持在77.2 kHz，而經(jīng)過5 h后，傳感器的共振頻率再一次提高到了77.5 kHz，這是由牛奶黏度的變化所引起的，由于金黃色葡萄球菌的增殖分解了牛奶中的大分子物質(zhì)，導(dǎo)致牛奶黏度減小，因此牛奶對傳感器的消散作用減小，傳感器共振頻率增加，并在10 h時其共振頻率達到最大值后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，牛奶開始凝固，使得牛奶黏度上升，其對傳感器的消散作用增大，傳感器共振頻率減小。這一過程也與黏度試驗中的結(jié)果相一致。牛奶的黏度由初始的1.60 mPa·s 減小到1.45 mPa·s，之后牛奶的黏度再次上升到1.59 mPa·s。對比圖3、5，發(fā)現(xiàn)傳感器對其自身質(zhì)量的變化具有較快的響應(yīng)。雖然圖5顯示傳感器也能較好地反映黏度變化，但是牛奶中的金黃色葡萄球菌繁殖引起牛奶黏度變化的過程比較緩慢。

由于染色試驗使金黃色葡萄球菌在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色，圖6顯示傳感器上吸附了較少的細菌。假設(shè)傳感器上仍舊吸附適配體，那么適配體上定會吸附大量的金黃色葡萄球菌。顯然電鏡觀測結(jié)果與假設(shè)不相符，因此進一步證實了適配體從膜片上剝落的推測，這也是在初始的階段牛奶黏度沒有很明顯的變化而共振頻率有明顯上升的原因。

圖4 未染菌的牛奶中磁彈性傳感器在染色試驗后電鏡圖片

Figure 4 Electron microscopy image of magnetoelastic sensor in milk withoutStaphylococcusaureusafter dyeing test

圖5 磁彈性傳感器在含有金黃色葡萄球菌的牛奶中的頻率響應(yīng)曲線

Figure 5 Frequency response curve of magnetoelastic sensor in milk containingStaphylococcusaureus

圖6 染菌的牛奶中磁彈性傳感器在染色試驗后電鏡圖片

Figure 6 Electromagnetic image of magnetic elastic sensor in milk withStaphylococcusaureusafter dyeing test

4 結(jié)論

本試驗研究了磁彈性傳感器共振頻率的測量原理，并制備了檢測金黃色葡萄球菌的磁致伸縮無線傳感器，研究了有菌和無菌情況下磁彈性傳感器共振頻移。驗證了磁彈性傳感器共振頻率受到其自身質(zhì)量影響，同時也驗證了，磁彈性傳感器置于黏性液體中受到液體黏度的影響，但由于牛奶中金黃色葡萄球菌引起牛奶的黏度變化較為緩慢，相較于自身質(zhì)量變化，黏度變化不是快速檢測的最優(yōu)方案。此外發(fā)現(xiàn)磁彈性傳感器相對于線圈的位置變化也會引起共振頻移。

本次試驗驗證了這種磁彈性傳感器對檢測牛奶是否含有金黃色葡萄球菌具有較高的可行性。但忽略了磁彈性尺寸的影響，同時，牛奶的溫度也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，這些將在接下來的研究中進行探討。