于沛沛 夏文水 仲偉偉 劉曉麗 王 斌

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2. 江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

殼寡糖是由乙酰氨基葡萄糖苷(GlcNAc)和/或氨基葡萄糖苷(GlcN)通過β-1,4糖苷鍵連接而成的聚合度為2～20的寡糖。殼寡糖具有多種優(yōu)越的生理功能和生物活性[1]，尤其是聚合度為3～6的殼寡糖，因具有調(diào)節(jié)免疫[2]、抗衰老[3]、抗疲勞[4]、清除自由基[5]等功能而引起了廣泛的關(guān)注。

由于殼寡糖分子中含有較多的氨基和羥基，其分子間或分子內(nèi)作用力較強(qiáng)，分離純化相對困難。目前，殼寡糖的分離純化方法主要有：膜分離法、凝膠滲透色譜法、薄層色譜法和離子交換色譜法等。凝膠色譜法是根據(jù)被分離組分的分子尺寸大小進(jìn)行分離的一種方法，可利用此法將少量殼寡糖分離成不同組分，但較難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[6]；薄層色譜法是根據(jù)各聚合度的寡糖極性不同，利用其在層析液中移動速度差異來進(jìn)行分離，由于殼寡糖極性較大，點樣承載量少，不適用于大量制備，一般常用來檢測和監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程[7]；離子交換色譜法是以離子交換樹脂或化學(xué)鍵合離子交換劑為固定相，根據(jù)被分離組分的離子交換能力的不同或選擇性系數(shù)的差別實現(xiàn)分離，該方法分離成本較高，連續(xù)性較差，僅適合實驗室研究，難以放大生產(chǎn)[8]。

目前工業(yè)上一般采用生物酶法對殼聚糖進(jìn)行降解后，進(jìn)行噴霧干燥而獲得殼寡糖，但得到的殼寡糖產(chǎn)品分子量分布較寬，其中含有一些未充分降解的殼聚糖大分子、殼聚糖水解酶、無機(jī)鹽、酸根離子及單糖、二糖等生物活性較低的糖等。因此，為得到聚合度為3～6的含量較高的殼寡糖產(chǎn)品，必須選擇合適的分離技術(shù)對酶解液進(jìn)行純化。

膜分離技術(shù)是根據(jù)被分離物質(zhì)與膜孔徑大小的差異來實現(xiàn)分離的，目前在低聚果糖的分離純化領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[9-10]，但在殼寡糖的分離純化中應(yīng)用相對較少，工業(yè)化應(yīng)用尚未得到推廣。本研究擬從殼寡糖分離純化效果和工業(yè)化生產(chǎn)要求等方面綜合考慮，對殼聚糖酶解液在實驗室前期超濾[11]基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行納濾操作，提高產(chǎn)品純度，并對納濾操作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，研究操作壓力、操作溫度、料液pH值對殼聚糖酶解液納濾純化分離效果的影響，以確定納濾操作的最佳工藝參數(shù)，為得到高活性的聚合度為3～6的殼寡糖的工業(yè)化分離純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

殼聚糖：Mw=5.8×105，脫乙酰度85.2%，水分11.2%，灰分0.62%，黏度60 cp，南通雙林海洋生物藥業(yè)有限公司；

復(fù)合纖維素酶：355 U/mL，浙江金殼生物化學(xué)有限公司；

高效硅膠板：10 cm×20 cm，青島海洋化工分廠；

其他試劑：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

雷磁電導(dǎo)率儀：DDS307型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

紫外—可見分光光度計：UV1800型，日本島津科技有限公司；

膜分離裝置：RO(NF)-UF-4050型，上海昊清環(huán)?？萍加邢薰荆?/p>

卷式超濾膜：HPS-10型，MWCO=10 kDa，膜面積0.4 m2，上海昊清環(huán)?？萍加邢薰?；

納濾膜名稱：1812型，截留分子質(zhì)量為500 Da，膜面積0.4 m2，上海昊清環(huán)?？萍加邢薰?；

高效液相色譜儀：1525型，美國沃特世公司。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖酶解液制備 酶解條件：復(fù)合纖維素酶添加量8 U/g，底物濃度5%，酶解溫度45 ℃，pH 4.5，酶解時間6 h，經(jīng)5 μm的微濾膜微濾處理后，參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行超濾處理。

1.2.2 納濾最優(yōu)工藝條件的確定

(1) 操作壓力：取1.5 L超濾液，控制料液濃度2%、操作溫度30 ℃、pH 5.0，分別在0.4～0.6 MPa壓力下，以納濾截留液的膜通量、氨基葡萄糖脫除率、電導(dǎo)率和pH值為指標(biāo)，研究操作壓力對酶解液納濾純化效果的影響。

(2) 操作溫度：取1.5 L超濾液，控制料液濃度2%、操作壓力0.5 MPa、pH 5.0，分別在25～40 ℃條件下，以納濾截留液的膜通量、氨基葡萄糖脫除率、電導(dǎo)率和pH值為指標(biāo)，研究操作溫度對酶解液納濾純化效果的影響。

(3) 初始pH值：取1.5 L超濾液，控制料液濃度2%、操作壓力0.5 MPa、操作溫度35 ℃，分別在初始pH 2.0～6.0條件下，以納濾截留液的膜通量、氨基葡萄糖脫除率、電導(dǎo)率和pH值為指標(biāo)，研究初始pH值對酶解液納濾純化效果的影響。

1.2.3 各指標(biāo)的測定

(1) 膜通量的計算：

(1)

式中：

J——膜通量，L/ (m2·h)；

V——透過液體積，L；

A——有效膜面積，m2；

t——時間，h。

(2) 氨基葡萄糖的測定：采用Elson-Morgan法[12-13]。氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=8.583 4x+0.032 7，R2=0.995 5。其中y為A525 nm；x為氨基葡萄糖濃度(mg/mL)。

(3) 電導(dǎo)率的測定：用電導(dǎo)率儀測定。

(4) 殼寡糖平均分子質(zhì)量的測定：采用乙酰丙酮法[14]。

(5) 分離產(chǎn)物TLC分析：用毛細(xì)吸管分別吸取5%的超濾前后的殼寡糖溶液1 μL，點于高效硅膠板上，各點之間間距0.5 cm，距底端距離1.0 cm，置于展開體系為異丙醇∶水∶氨水=60∶30∶4(體積比)的層析缸中，待展開距頂端為1.0 cm時取出并吹干。硅膠板上噴灑0.5%的茚三酮顯色劑，置于100 ℃烘箱中加熱5 min顯色。

(6) 殼寡糖的HPLC分析：采用高效液相色譜檢測器[15]，色譜條件：1525型高效液相色譜儀，蒸發(fā)光反射檢測器，Shodex Asahipak NH2P-50 4E(4.6 mmID×250 mmL)色譜柱；柱溫30 ℃；流動相為乙腈∶水=75∶25(體積比)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；樣品濃度5%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法 進(jìn)行3次平行試驗，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)差異顯著性分析，以P<0.05為差異顯著，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納濾分離條件

2.1.1 操作壓力對納濾分離效果的影響 由圖1可知，膜通量隨操作壓力的增強(qiáng)而增大，但壓力越大，膜通量下降速率也越快。納濾后期，在0.5，0.6 MPa下，膜通量均穩(wěn)定在20 L/(m2·h) 左右。這是由于隨壓力增強(qiáng)，溶質(zhì)對流遷移到膜表面的速率增大，濃差極化層壓實或增厚，導(dǎo)致膜通量迅速衰減。由圖2可知，納濾截留液pH值隨運行時間的延長而逐漸上升，最終穩(wěn)定在pH 5.0左右，不同操作壓力下截留液pH值變化不明顯。由圖3可知，氨基葡萄糖脫除率隨操作壓力的增強(qiáng)而增大，并隨運行時間的延長逐漸上升，35 min 后趨于平緩，0.5，0.6 MPa下氨基葡萄糖脫除率均在81%左右。由圖4可知，在各壓力條件下，納濾前期截留液電導(dǎo)率均隨運行時間延長而下降，且操作壓力越大，電導(dǎo)率越低。納濾后期，截留液電導(dǎo)率差別不明顯。綜合以上結(jié)果，雖然操作壓力越大，氨基葡萄糖的脫除效果越好，但納濾后期，對鹽和氫離子的脫除效果差別不大；且操作壓力再加大，由濃差極化造成的膜污染導(dǎo)致通量衰減越快，膜污染層不斷壓實，膜孔逐漸減小，會造成膜的不可逆污染。隨時間的延長，在0.5，0.6 MPa下膜通量均在20 L/(m2·h)左右，運行效率較高。因此，從膜的使用壽命和純化效果綜合考慮，確定操作壓力為0.5 MPa。

圖1 膜通量隨運行時間的變化

圖2 pH值隨運行時間的變化

圖3 氨基葡萄糖脫除率隨運行時間的變化

圖4 電導(dǎo)率隨運行時間的變化

2.1.2 操作溫度對納濾分離效果的影響 由圖5、6可知，膜通量隨溫度升高而增大，這是由于溫度升高使溶液中的分子熱運動加劇，溶液動力黏度減小[16-17]，溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)增加，膜通量增加；不同操作溫度下，截留液pH值差別不明顯，pH值隨運行時間的延長而逐漸上升，最終穩(wěn)定在5.0左右；由圖7可知，隨溫度升高，氨基葡萄糖脫除率增大，但在納濾后期，35，40 ℃下的氨基葡萄糖脫除率無顯著性差異(P>0.05)，最終穩(wěn)定在85%左右；由圖8可知，在各溫度條件下，截留液電導(dǎo)率均隨運行時間延長先逐漸減小后趨于平緩，溫度越高，截留液電導(dǎo)率越低，但溫度過高容易使寡糖發(fā)生褐變，也使得能耗增加。在35，40 ℃下的氨基葡萄糖脫除率無顯著性差異(P>0.05)，且在35 ℃時，膜通量約為20 L/(m2·h)，運行效率較高。因此，在保證較高的氨基葡萄糖脫除效率和膜通量前提下，確定操作溫度為35 ℃。

圖5 膜通量隨運行時間的變化

圖6 pH值隨運行時間的變化

圖7 氨基葡萄糖脫除率隨運行時間的變化

圖8 電導(dǎo)率隨運行時間的變化

2.1.3 料液初始pH值對納濾分離效果的影響 如圖9所示，膜通量隨料液初始pH值的增大而減小，且隨運行時間的延長，膜通量呈緩慢下降的趨勢；由圖10可知，pH值為2.0，3.0，4.0的制備液隨納濾運行時間的延長，截留液pH值逐漸上升，最終穩(wěn)定在pH 5.0左右，而pH值為5.0，6.0的制備液在整個納濾過程中，截留液pH值基本保持不變；由圖11 可知，氨基葡萄糖脫除率隨料液初始pH值的升高而逐漸上升后趨于穩(wěn)定；圖12中溶液電導(dǎo)率隨運行時間延長而不斷下降，最終趨于穩(wěn)定。這是由于改變?nèi)芤簆H值能夠改變?nèi)芤褐芯垭娊赓|(zhì)的構(gòu)型和分散性，從而減小或防止對膜的污染[18]，使膜通量增加。酸性條件下，殼寡糖氨基質(zhì)子化帶正電荷，分子之間存在靜電排斥，pH越低，分子之間作用力越強(qiáng)[19]，分子結(jié)構(gòu)折疊越少，越容易透過，隨pH升高，寡糖分子上的電荷減少，排斥力減弱，分子間形成氫鍵，在氫鍵的作用下相互卷曲、折疊，在膜表面產(chǎn)生堆積，導(dǎo)致膜通量下降，氨基葡萄糖脫除率降低，脫鹽效果變差。韓永萍等[17]、董惠忠等[20]通過調(diào)節(jié)溶液pH值來提高膜分離效果，也得到相似結(jié)論?？紤]到膜的最低耐受pH值為2.0，長時間在此條件下進(jìn)行納濾操作可能會造成膜的不可逆性損壞，且pH值2.0，3.0時氨基葡萄糖脫除率差別不大，因此，綜合純化效果與實際生產(chǎn)要求，將納濾料液初始pH值確定為3.0。

圖9 膜通量隨運行時間的變化

圖10 pH值隨運行時間的變化

圖11 氨基葡萄糖脫除率隨運行時間的變化

圖12 電導(dǎo)率隨運行時間的變化

2.2 納濾后殼寡糖各指標(biāo)分析

在操作壓力0.50 MPa、操作溫度35 ℃、料液pH 3.0條件下，對殼聚糖超濾液進(jìn)行納濾操作，圖13為納濾前后殼寡糖的薄層色譜圖，根據(jù)殼二糖標(biāo)準(zhǔn)品判斷，從上到下依次為氨基葡萄糖、聚合度為2～6寡糖。從圖13可以看出，納濾截留液中氨基葡萄糖顯色點非常淺，說明其含量很少，進(jìn)一步對殼寡糖的納濾截留液和透過液進(jìn)行HPLC分析，從圖14 可以看出，截留液的HPLC圖中有5個峰出現(xiàn)，出峰時間7.102 min時為氨基葡萄糖，往后依次為殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖，氨基葡萄糖峰面積小，說明其含量低。從圖15可以看出，透過液中只有雜質(zhì)和氨基葡萄糖，無其他聚合度的殼寡糖出現(xiàn)，說明此納濾膜對聚合度為2及以上的寡糖不能透過。從表1中可以看出，納濾后樣品中氨基葡萄糖含量為1.21%，脫除率為85.52%，灰分由1.12%降為0.15%，脫鹽率達(dá)95.54%，聚合度為3～6寡糖含量為70.25%，最終產(chǎn)品得率為70.12%，1%殼寡糖水溶液pH值為4.92。

表1 納濾分離前后殼寡糖主要理化指標(biāo)

1. 殼二糖標(biāo)品 2. 納濾截留液 3. 納濾原液 4. 納濾透過液

圖14 納濾截留液高效液相色譜圖

圖15 納濾透過液高效液相色譜圖

3 結(jié)論

本研究在前期采用相對截留分子質(zhì)量為10 kDa的卷式超濾膜，對殼聚糖酶解液進(jìn)行超濾的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用高效率、低成本的納濾技術(shù)對殼聚糖酶解液進(jìn)行分離純化，即用相對截留分子質(zhì)量為500 Da的卷式納濾膜進(jìn)行納濾，確定了最佳的操作參數(shù)為：操作壓力0.50 MPa、操作溫度35 ℃、濾液pH 3.0。納濾后測定產(chǎn)品成分：氨基葡萄糖含量為1.21%、灰分為0.15%、聚合度為3～6寡糖的含量提高到70.25%、最終產(chǎn)品得率為70.12%。研究結(jié)果表明，在前期超濾操作的基礎(chǔ)上，對殼聚糖酶解液進(jìn)一步進(jìn)行納濾操作，能有效地提高產(chǎn)品中聚合度為3～6寡糖的含量，且膜分離技術(shù)操作簡單，是工業(yè)化純化殼寡糖的理想工藝技術(shù)。本試驗選擇截留分子質(zhì)量為500 Da的納濾膜，可以有效去除氨基葡萄糖，但對殼二糖去除作用不強(qiáng)，需進(jìn)一步選擇不同孔徑或材料的膜，提高產(chǎn)品中聚合度為3～6寡糖的含量。后續(xù)將對殼寡糖在納濾分離過程中的傳質(zhì)機(jī)理，不同分離條件對寡糖分子微觀結(jié)構(gòu)的影響等作進(jìn)一步探討。