云耀峰 梁潤 郝靈芳 蒼宏宇 常青

(1.呼和浩特市第一醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma, TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其上升幅度居惡性腫瘤之首，且發(fā)病人群逐漸趨向年輕化[1]，故其近年備受關注，并成為腫瘤研究的熱點。其常用診斷方法包括觸診、超聲、核素顯像、細針穿刺細胞學活檢等，其中細針穿刺細胞學活檢是篩查和早期診斷甲狀腺癌的金標準，但存在一定的假陰性率和部分無法確診的病例，且需考慮患者的依從性[2-3]。因此，研究鑒定早期診斷預警分子，是目前甲狀腺癌臨床研究所面臨的瓶頸問題。越來越多的實驗數(shù)據(jù)逐步建立了腫瘤與miRNA表達變化的關聯(lián)，提示我們在不同的腫瘤中檢測特定的miRNA表達變化很可能成為腫瘤診斷、分期和預后預測的有力工具[4-5]。為了進一步證實其臨床效果，我們進行了此次研究，現(xiàn)將結(jié)果報告于下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月～2017年8月多中心收集的行甲狀腺手術的40例甲狀腺癌(乳頭狀癌、濾泡癌各20例)、癌旁正常甲狀腺組織(N-PTC)及20例良性甲狀腺疾病組織(MNG)。其中男性21例，女性39例；年齡16～65歲，平均(39.2±4.4)歲。采集前所有研究對象均了解研究的整個過程，且自愿參與，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準?；颊咝g前均未進行放化療治療，且不伴有影響研究的相關疾病，見表1。

1.2 方法 樣本總RNA的提取：將組織標本在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入RNA提取試劑(Trizol試劑)1ml充分混勻，提取組織中總RNA[6]。逆轉(zhuǎn)錄PCR：取總RNA 1μl，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明加入各種反應試劑，然后42℃反應15min,85℃反應5s,4℃反應15min，后在-80℃下保存?zhèn)溆肹7]。實時PCR：取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl，加入PCR反應試劑。將盛有混合物的反應管置于實時PCR反應儀中，反應條件為95℃預變性15min，再按95℃反應15s,60℃反應1min，擴增40個循環(huán)，實驗重復3次[8]。

1.3 評價標準 聚合酶鏈式反應(PCR)剛開始進入到對數(shù)期的時候，原始模版的體系及濃度等差異暫時沒有放大，擴增目的片斷的量可以近似地看作僅僅與擴增效率及起始模板的濃度相關。用Pt值表示擴增目的片斷的量，含義是PCR中熒光信號達到規(guī)定閾值時的循環(huán)數(shù)。內(nèi)參應用U6表示，陰性對照選擇水。應用2-△△PT值表示樣品目的基因的相對表達率(PQ)。△PTtumor=Pt(待測基因)-Pt(管家基因 U6)，△PTnormal=Pt(待測基因)-Pt(管家基因 U6),△△PT=△PTtumor-△PTnormal，RQ=T÷N=2-△△PT(變化倍數(shù) fold-change),Log2[T/N]=-△△PT。當RQ<1時，表示甲狀腺癌組織中的目的基因的表達水平較良性病變組織內(nèi)的目的基因的表達水平低；當RQ>1時，表示甲狀腺癌組織中的目的基因的表達水平較良性病變組織內(nèi)的目的基因的表達水平高。

表1 兩組研究對象臨床資料比較(n，×10-2)Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

2 結(jié)果

2.1 miRNA與甲狀腺癌的病理關系 在甲狀腺癌患者中，miR-221、miR-222的表達與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、雙葉腫瘤等指標無明顯相關性(P>0.05)，而與TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移情況有關，見表2；miR-222在miR-197和miR-346的表達在20例甲狀腺濾泡癌中均有明顯升高，其余未見顯著變化，見表3。

表2 miR-221、miR-222的表達與甲狀腺癌病理及臨床特征的關系Table 2 The relationship between the expression of mir-221 and mir-222 and thyroid cancer pathology

Table3RelationshipbetweentheexpressionofmiR-197andmiR-346andthepathologicalchangesofthyroidcarcinoma

腫瘤類型nmiR-197表達量PmiR-346表達量P乳頭狀癌200.89±0.080.020.93±0.050.00濾泡癌 203.89±0.094.11±0.09

2.2 miRNA分子在相應組織標本中的表達水平 miR-221與miR-222在良性甲狀腺疾病組織的表達量變化不明顯,但是在甲狀腺癌組織中的表達變化顯著，即在甲狀腺乳頭狀癌中表達顯著，兩者與PTNE的表達均呈負相關(t221=-0.12,P221=0.00;t222=-0.13,P222=0.00)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在癌旁正常組織中的表達無明顯變化，見表4。在良性甲狀腺疾病組織中miR-197和miR-346表達沒有顯著差異(P>0.05)；在20例濾泡癌組織中明顯升高(P<0.05)，在乳頭狀癌組織及癌旁正常組織中均無明顯變化，見表5。

Table4ExpressionlevelofmiR-221andmiR-222inthecorrespondingtissuespecimens

標本miR-221PmiR-222P良性甲狀腺疾病 病灶組織0.34±0.030.240.39±0.050.11 正常組織0.32±0.070.40±0.09甲狀腺癌 病灶組織0.85±0.010.000.99±0.020.00 癌旁正常組織0.31±0.070.40±0.01

3 討論

甲狀腺癌的發(fā)病率雖然只占全身腫瘤的1%、甲狀腺結(jié)節(jié)的5%，但卻是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤之一[9]。甲狀腺癌的發(fā)病隱匿，最初表現(xiàn)為無痛性甲狀腺結(jié)節(jié)，臨床診斷相當困難。當前多采用超聲、觸診、磁共振、細針穿刺細胞學活檢、CT及核素顯像等方法進行診斷，其中細針穿刺細胞學活檢是篩查及早期診斷甲狀腺癌較為有效的方法，但仍然存在一些假陰性和無法確診的病例[10-11]。因此，對早期診斷預警分子的研究與鑒定成為了目前甲狀腺癌所面臨的瓶頸問題，在臨床上有著重要的價值。

Table5LevelsofexpressionofmiR-197andmiR-346inthecorrespondingtissuespecimens

標本miR-197PmiR-346P良性甲狀腺疾病 病灶組織0.35±0.020.270.41±0.050.31 正常組織0.33±0.040.40±0.07甲狀腺癌 病灶組織4.11±0.090.003.89±0.090.00 癌旁正常組織0.41±0.040.40±0.03

近年來，大量臨床數(shù)據(jù)表明多種腫瘤的發(fā)生均與miRNA的異常表達有著密切關系，提示我們在不同的腫瘤中對特定的miRNA表達變化進行檢測很有可能會成為腫瘤診斷、分期及預后預測的有力工具[12-13]。miRNA是內(nèi)原性非編碼的一類小RNA,以堿基互補的形式與靶基因的表達相結(jié)合予以調(diào)控。miRNA不僅參與機體生長發(fā)育等正常生理過程，且在腫瘤等多種疾病的病理發(fā)展中扮演著重要角色[15]。在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，miRNA能夠下調(diào)基因的表達；與此相反，具有癌基因樣功能的miRNA，能夠?qū)σ职┗虻谋磉_進行抑制。如果這些具有很強控制力的miRNA有了異常的變化，會將癌基因和抑癌基因之間的平衡破壞，最終導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在甲狀腺增生性結(jié)節(jié)是否行手術切除的判斷中，臨床上多采用術前細針穿刺，而miRNA技術僅僅可以依靠少量的細針穿刺標本就能予以診斷，可有效地對甲狀腺結(jié)節(jié)與甲狀腺腫瘤進行區(qū)分，將不必要的甲狀腺切除手術避免[14-15]。

研究表明，在大多數(shù)腫瘤組織中miRNA分子家族的miR-221和miR-222均呈高表達水平[16]。本研究也證實甲狀腺癌中miR-221和miR-222的表達量明顯高于正常甲狀腺組織，表明其對甲狀腺癌的檢查結(jié)果會有一定的診斷輔助作用。在甲狀腺癌中，miR-221和miR-222的高表達與p27kip1蛋白的低水平表達有著密切的聯(lián)系，體外將miR-221與miR-222轉(zhuǎn)入到甲狀腺癌細胞中，會明顯減少p27kip1蛋白的表達，同時也抑制了兩者的表達，miR-221與miR-222的調(diào)控位點存在于p27kip1的3’-URT中，而細胞周期的調(diào)控有p27kip1的參與，充分表明甲狀腺癌細胞周期的調(diào)控中有miR-221與miR-222的參與。另外，miR-221和miR-222在細胞的分化及生長過程中也發(fā)揮著重要作用[17-18]。本研究證實，TNM分期越高，miR-221和miR-222的表達水平也就越高，意味著miR-221和miR-222很可能在參與甲狀腺癌發(fā)展及惡化過程中起到了重要作用；同時在甲狀腺癌存在淋巴轉(zhuǎn)移中的表達明顯高于非淋巴轉(zhuǎn)移組織，故其與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關，其機制可能為miR-221和miR-222抑制了長壽保障基因和蛋白絡氨酸磷脂酶u等，從而加速了甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移，表明其與復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移也有著密切的聯(lián)系。此外，本研究還顯示，miR-221和miR-222在甲狀腺乳頭狀癌中呈負相關，表明miRNA在甲狀腺腫瘤的診斷中有著潛在的應用價值。

濾泡狀甲狀腺癌的惡性程度明顯高于乳頭狀甲狀腺癌，且兩者多伴隨發(fā)生。在濾泡狀甲狀腺癌的發(fā)生過程中，多種miRNA具有不同程度的高表達，這種細胞的表達多與細胞的類型有關系[19]。Weber等[20]研究證實miR-197和miR-346會導致濾泡狀甲狀腺癌133和K5細胞系的增長停滯，但是對乳頭狀甲狀腺癌卻無影響；亦證實了miR-197和miR-346沉默將會對濾泡狀甲狀腺癌的治療起到很大的促進作用。本研究表明，miR-197和miR-346在乳頭狀甲狀腺癌、正常組織和良性甲狀腺疾病組織中的表達均無顯著性，但在濾泡狀甲狀腺癌中卻呈現(xiàn)高表達，因此miR-197和miR-346對濾泡狀甲狀腺癌的診斷與治療有著重要的臨床價值。此次研究有如下創(chuàng)新：①發(fā)現(xiàn)某種新型的miRNA，作為甲狀腺癌早期診斷、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移密切相關的預警分子，為甲狀腺癌手術方式選擇及術后指導治療提供了參考及依據(jù)。②首次通過同一患者多中心性甲狀腺癌miRNA表達差異性情況，驗證其多灶性起源問題，并有望為今后甲狀腺癌特別是分化型甲狀腺癌手術術式提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，不同病理類型及分期甲狀腺癌中miRNA表達的不同，可為臨床早期診斷、預后分級、手術方式及術后治療提供判斷依據(jù)，可有效提高患者的生存質(zhì)量和預期壽命，減輕患者的經(jīng)濟負擔，減少醫(yī)院醫(yī)療資源浪費，合理優(yōu)化醫(yī)療資源配置，具有較好的臨床及經(jīng)濟價值。